免疫熒光（IF）方案
原理
免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術(比如流式細胞儀)測定含量。
免疫熒光技術有兩個主要步驟：首先，在抗體的作用下，將抗體與抗原結合；其次，將熒光染料通過實時抗體分子結合抗原，使抗原表位處發(fā)出熒光信號，以此來檢測抗原的存在與否。
利用免疫熒光技術的主要優(yōu)勢在于可以用來檢測幾乎所有的抗原表位，提供一種高精度的檢測方法，可以在原來檢測抗體特異性的抗原表位上提升靈敏度。此外，免疫熒光技術還可以用來檢測細胞內特異性抗原，可以提供細胞內特征信息，對細胞功能和表型的研究有重要的意義。
用途
檢測細胞或組織內抗原或半抗原的定位或相對表達。
步驟
1. 樣品準備
● 細胞樣品的制備
熒光顯微鏡用于檢測熒光信號。為了與該設備兼容，細胞需要在特定的材料上培養(yǎng)。典型的包括玻璃底細胞培養(yǎng)皿和玻璃蓋片。細胞密度不宜過大。
● 組織樣本的準備
石蠟切片需要脫蠟、水化和抗原修復步驟(參考免疫組化方案),然后與抗體 孵育進行熒光檢測。
冷凍切片應先在室溫平衡10-20min。 然后，切片用4%甲醛固定10-15min。 用0.2% TritonX-100 滲透20min, 并對細胞樣品進行滲透。
2. 固定和滲透作用
樣品的固定和滲透是決定實驗成功的關鍵步驟。醛基固定劑(如甲醛、福爾馬林和戊二醛)和脫水固定劑(如乙醇)常被用作固定劑。基于醛的固定劑穿過細 胞膜，也可以與細胞蛋白質交聯(lián)，穩(wěn)定和硬化樣品。與脫水固化劑相比，醛基固化劑效果更好。所以我們建議用4%的甲醛固定細胞。為了使抗體接觸到目標蛋白，需要進行滲透作用。洗滌劑常被用作滲透試劑。推薦使用TritonX- 100。它能破壞細胞膜結構，在細胞膜上形成許多小孔。這些小孔為抗體提供了一個通道，使其能夠接觸到目標蛋白質。與醇類相比，醛類能更好地穿過質膜并固定可溶性蛋白，但某些靶標在醛類交聯(lián)時會失去抗原性。
(1) 用PBS 沖洗細胞三次。
(2) 用4%甲醛固定細胞10-15min
(3) 用PBS 沖洗細胞三次。
(4) 用1% Triton X-100于室溫滲透細胞20分鐘。
(5) 用PBS 沖洗細胞三次。
3. 封閉
這一過程是為了減少抗體與其他非特異性蛋白質之間的非特異性結合。我 們常用的阻斷液是正常的山羊血清(品種必須與二抗一致)。血清不僅能阻斷非特異性結合蛋白，還能阻斷細胞或組織中的FC受體。
(1) 用10%正常山羊血清于室溫阻斷1h。
(2) 擦去多余的液體，保持樣品濕潤。
4. 抗體孵育
(1) 按照推薦的稀釋比例制備一抗溶液，使樣品完全覆蓋在一抗溶液中。
(2) 一抗4℃孵育過夜。
(3) 用PBS沖洗細胞三次。
(4) 按照推薦稀釋比例在暗處制備二抗溶液，使樣品完全覆蓋在一抗溶液。
(5) 二抗室溫孵育1h。
(6) 用PBS沖洗細胞三次。
5. 核染色
DAPI常被用作核試劑，以使細胞結構更清晰。按說明書稀釋DAPI試劑，與樣品孵育適當時間。染色時間不宜過長。
6. 檢測
將樣品置于黑暗中，盡快用熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描檢測熒光信號。
常見問題
1. 整個細胞片都出現(xiàn)熒光亮點?
(1) 二抗?jié)舛冗^高，適當降低二抗?jié)舛燃纯伞?/p>
(2) 二抗發(fā)生沉淀，可以使用過濾或者離心熒光標記二抗。
2. 信號弱或無信號，染色細胞過少?
(1) 目標蛋白在細胞中沒有表達；制備細胞裂解液，用 Westerm Bloting 驗證目標蛋白在細胞中是否表達；
(2) 表達目標蛋白的細胞過少：標本中使用更多的細胞，試用其他瞬時轉染方法，或者使用穩(wěn)定轉染細胞系；
(3) 細胞通透性差：增加通透劑作用的時間或者濃度，或改用其它的通透；
(4) 染色前的固定步驟破壞了抗原表位：改用其他固定方法；
(5) 通透處理使抗原丟失：減少通透劑作用的時間或強度；
(6) 抗體不識別：換用其他抗體；
(7) 一抗稀釋度過大：同一樣品按最佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定 更佳的一抗稀釋比例；
(8) 二抗選擇錯誤：使用正確的二抗。
3. 只有 DAPI 的藍光，目的熒光幾乎沒有或者很弱。
出現(xiàn)這種現(xiàn)象很有可能是抗體比例太低，需提高抗體濃度，可配合提高二抗 濃度；共聚焦的激發(fā)熒光強度不夠大；二抗是否是對應的種屬，比如本來需要山羊抗鼠結果加為山羊抗免。
4. 細胞核周圍總是存在有一些藍色的小點點。
此種情況一般是支原體污染所致，建議用殺支原體藥2 周后再檢測，或者通 過提高共聚焦背景值來覆蓋支原體熒光。
5. 共定位的視野該如何選擇?
共定位時，首先判斷哪些細胞是轉染成功的，比如我過表達了蛋白A,想做蛋白A和蛋白B的共定位關系，則在視野中尋找已成功轉染蛋白A的細胞，一般熒光強度會顯著高于周邊其他細胞，再在這個細胞上觀察蛋白B的表達。
6. 視野中細胞之間存在散在的發(fā)光點。
有兩種情況可造成：
(1) 拍照時PBS量過少引起的非特異性；
(2) PBS未過濾，未溶解的殘渣黏附而導致。
