單抗制備技術(shù)對(duì)比
單克隆抗體（Monoclonal antibodies，mAb）是由B細(xì)胞產(chǎn)生，并能特異性靶向抗原的免疫球蛋白。單克隆抗體不僅是生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中必不可少的工具，其在臨床治療上的應(yīng)用也以革命性的速度改進(jìn)了多種疑難雜癥的治療方法。
1975年Köhler和Milstein提出的雜交瘤技術(shù)（Hybridoma technology），使得大量獲得單克隆抗體成為可能，為基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用提供了無(wú)限潛力。其他科學(xué)和技術(shù)進(jìn)步也促進(jìn)了單克隆抗體的發(fā)展、豐富了單克隆抗體的制備方法。
經(jīng)過(guò)近50年的發(fā)展，單克隆抗體制備方法不再局限于免疫小鼠的淋巴細(xì)胞術(shù)，噬菌體展示技術(shù)（Phage display）、人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠（Human antibody-producing mice）和單B細(xì)胞抗體技術(shù)（Single B cell antibody technology）也都陸續(xù)登上舞臺(tái)。這些方法雖然有各自的局限性，但都已廣泛應(yīng)用于單克隆抗體篩選。同時(shí)，這些技術(shù)都不完全是獨(dú)立存在的，如果能充分利用各技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，采用靈活的方法將各技術(shù)優(yōu)化組合就能更加高效、快速地進(jìn)行抗體開(kāi)發(fā)。
1. 雜交瘤技術(shù)
雜交瘤技術(shù)是一種將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合生產(chǎn)小鼠單克隆抗體的傳統(tǒng)方法，是目前應(yīng)用最廣泛的單克隆生產(chǎn)技術(shù)。在這種技術(shù)中，首先收集免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞，并將其與BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，從而形成永生化的雜交瘤細(xì)胞。然后篩選雜交瘤細(xì)胞，鑒定出能生產(chǎn)特異性抗體的單克隆細(xì)胞株。十幾年后，1988年，兔單克隆抗體制備方法首次被《Science》雜志報(bào)道 [1]。該研究使用小鼠-兔異種雜交瘤方法生產(chǎn)兔單克隆抗體，但鼠-兔異種雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的效率較低、不穩(wěn)定，且無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間分泌抗體。時(shí)間進(jìn)展到90年代中期，1995年，《PNAS》報(bào)道了能穩(wěn)定生產(chǎn)兔單抗的兔-兔雜交瘤細(xì)胞 [2]。但兔雜交瘤細(xì)胞也被證明不如常規(guī)鼠雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，這大大阻礙了其實(shí)驗(yàn)室水平的廣泛使用。并且，由于融合和轉(zhuǎn)化效率低下，使用兔雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體在應(yīng)用推廣中受到了極大的限制。
經(jīng)過(guò)多年發(fā)展及應(yīng)用，雜交瘤技術(shù)作為一種成熟的產(chǎn)生鼠單克隆抗體的方法已被廣泛應(yīng)用于多種抗體的生產(chǎn)。然而，由于缺乏合適的骨髓瘤融合伴侶，雜交瘤技術(shù)一直局限于免疫嚙齒動(dòng)物。20世紀(jì)80年代，《PNAS》報(bào)道了一種應(yīng)用人雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)治療用抗體的文章 [3]。利用該方法可以在無(wú)額外修飾的情況下產(chǎn)生天然的人源抗體，并用于臨床治療。隨著融合伴侶和電融合技術(shù)的發(fā)展，人雜交瘤細(xì)胞融合成功率逐步增加，這將在未來(lái)促進(jìn)治療性抗體的開(kāi)發(fā)。
2. 噬菌體展示技術(shù)
1990年開(kāi)始，噬菌體展示技術(shù)被視為一種新的產(chǎn)生單克隆抗體的方法。這種方法是從淋巴細(xì)胞中收獲抗體可變區(qū)基因（V gene）全集，克隆VHs和VLs的組合并與外殼蛋白融合后表達(dá)于絲狀噬菌體表面，然后篩選表達(dá)特異性抗體的噬菌體。與受限于嚙齒動(dòng)物的雜交瘤技術(shù)相比，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物種中篩選和分離單克隆抗體 [4,5]。2000年，Rader等人首次介紹了應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)生產(chǎn)兔單克隆抗體的全過(guò)程 [6]。在這篇文章中，Rader等人用噬菌體展示技術(shù)篩選和人源化的人A33兔抗體，不僅對(duì)人A33抗原有高特異性，且保留高親和力。目前，噬菌體展示技術(shù)因?yàn)槠涓咝А⒑?jiǎn)便及體外控制在原核或真核系統(tǒng)中原則參數(shù)的能力正逐步成為生產(chǎn)治療用抗體的重要技術(shù)平臺(tái)。
隨著我們對(duì)抗體結(jié)構(gòu)、功能和序列多樣性研究的不斷深入，除了原有的抗體庫(kù)外，一種新的合成抗體庫(kù)技術(shù)也在不斷發(fā)展。例如，HuCAL&Ylanthia文庫(kù)中，為了使篩選出的人源抗體能更好的進(jìn)行分子識(shí)別，將精確設(shè)計(jì)的序列插入抗原結(jié)合位點(diǎn)，并優(yōu)化設(shè)計(jì)多種可變重鏈、輕鏈框架區(qū)域 [7-10]。隨著文庫(kù)設(shè)計(jì)和篩選方法的不斷進(jìn)步，合成抗體文庫(kù)將成為快速生產(chǎn)具有高特異性和高親和力單克隆抗體不可或缺的工具。
3. 人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠
1985年，Alt等人首次提出將人抗體基因引入小鼠種系并使用轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生人抗體的想法 [11,12]。隨著基因編輯技術(shù)的進(jìn)步，使用人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)人源化抗體已不再是天方夜譚。與其他技術(shù)相比，使用人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠有許多優(yōu)勢(shì)，如無(wú)需人源化、具有更多的生物多樣性，且由于體內(nèi)成熟具有天然的親和力。但是，人免疫球蛋白體量龐大對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠抗體生產(chǎn)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。為了克服這些困難，研究人員們通過(guò)使用不同策略已成功地獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的人源抗體庫(kù)，如全人源抗體小鼠和嵌合人源抗體小鼠等。
4. 單B細(xì)胞抗體技術(shù)
雖然雜交瘤技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)在單克隆抗體生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，但它們依然存在較難克服的缺點(diǎn)制約著抗體生產(chǎn)過(guò)程。近些年，為了克服雜交瘤技術(shù)細(xì)胞融合效率低，噬菌體展示技術(shù)導(dǎo)致重鏈、輕鏈的天然同源配對(duì)丟失等問(wèn)題，單B細(xì)胞抗體技術(shù)正被逐步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，單B細(xì)胞抗體技術(shù)包含以下幾個(gè)步驟：
a. 從外周血或免疫器官中初步提取淋巴細(xì)胞；
b. 使用磁性活化細(xì)胞分選（MACS）或熒光活化細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)鑒定和分離出特定的B細(xì)胞；
c. 將分離出的B細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)；
d. 使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和抗體特異性引物鑒定單B細(xì)胞分泌抗體的特異性；
e. 擴(kuò)增特異抗體基因；
f. 將抗體基因克隆到表達(dá)載體中，并在細(xì)菌或細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)；
g. 純化表達(dá)產(chǎn)生的抗體，并用ELISA等方法進(jìn)行評(píng)估。
單B細(xì)胞抗體技術(shù)現(xiàn)在已廣泛用于人和小鼠單克隆抗體生產(chǎn)，如一些治療性中和單抗，可用于治療多種疾病，包括癌癥、自身免疫性疾病和傳染性疾病亡 [13,14]。
| 方法 | 雜交瘤技術(shù) | 人源抗體轉(zhuǎn)基因小鼠 | 噬菌體展示技術(shù) | 單B細(xì)胞抗體技術(shù) |
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| 優(yōu)勢(shì) |
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| 劣勢(shì) |
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參考文獻(xiàn)
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