天然染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）方案

用法說明

ChIP（染色質(zhì)免疫沉淀）是一種用于研究蛋白與DNA在自然狀態(tài)下的相互作用的技術(shù)。它依賴于特定抗體與抗原的特異性反應(yīng)，因此能夠真實(shí)地反映蛋白因子和基因組DNA在體內(nèi)的結(jié)合情況。目標(biāo)蛋白與DNA進(jìn)行交聯(lián)，然后通過聲波破碎或酶切分解DNA成小片段。通過抗體和抗原之間的特異性反應(yīng)，我們可以沉淀下預(yù)測(cè)的DNA片段。這個(gè)過程特異性地富集了與目標(biāo)蛋白結(jié)合的DNA片段。最后，我們可以從復(fù)合物中純化DNA，并根據(jù)PCR或qPCR的協(xié)議驗(yàn)證DNA。

溶液和試劑

反應(yīng)緩沖液：1mM CaCl₂，0.2% Triton X-100或NP-40，50mM Tris-HCl（pH 7.6）

RIPA緩沖液：0.1% SDS，0.1% NaDOC，1% Triton X-100，1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH 7.6）

LiCl緩沖液：0.25M LiCl，0.5% NP-40，0.5% NaDOC，10mM Tris-HCl（pH 7.6）

TE緩沖液：1mM EDTA，10mM Tris-HCl（pH 7.6）

樣品制備

交聯(lián)和裂解-轉(zhuǎn)錄因子和輔助因子

細(xì)胞在10厘米培養(yǎng)皿中以20毫升培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%時(shí)，可用于進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞數(shù)量的選擇取決于您研究的目標(biāo)蛋白質(zhì)。您可以參考以下表格：

蛋白質(zhì)	細(xì)胞數(shù)（用于ChIP反應(yīng)）	蛋白靶豐度
組蛋白蛋白質(zhì)RNA聚合酶II	10⁴	高
轉(zhuǎn)錄因子	10⁵-10⁶	中等
輔因子	10⁷?或更多	低

為了確保更好的結(jié)果，我們建議使用超過4×10⁶個(gè)細(xì)胞進(jìn)行組蛋白和RNA聚合酶II的ChIP實(shí)驗(yàn)，而轉(zhuǎn)錄因子或輔助因子則需要更多的細(xì)胞。

1. 取出培養(yǎng)皿并倒掉培養(yǎng)基。細(xì)胞數(shù)量約為2×10⁷個(gè)。

2. 用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞3次。

3. 添加1ml PBS，通過刮取的方式收集細(xì)胞。

4. 以2500轉(zhuǎn)/分鐘的速度，在4℃下離心3分鐘，收集細(xì)胞。

5. 通過向細(xì)胞中加入500μl反應(yīng)緩沖液（加入新鮮的蛋白酶抑制劑）來重新懸浮細(xì)胞，將其在冰上裂解10分鐘。

6. 以2500轉(zhuǎn)/分鐘的速度，在4℃下離心3分鐘，收集細(xì)胞。

7. 通過添加1ml反應(yīng)緩沖液和微量核酸酶，在37℃下反應(yīng)20分鐘。酶解條件應(yīng)參考微量核酸酶的說明書。處理時(shí)間和微量核酸酶的濃度應(yīng)通過初步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

8. 可以添加5mM EDTA來停止酶解反應(yīng)。

9. 使用超聲波打斷DNA，完全破碎。進(jìn)行6次5秒的超聲處理。

10. 以2500轉(zhuǎn)/分鐘的速度，在4℃下離心2分鐘。將上清液分離到一個(gè)新的管中。

11. 您可以取5μl上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，以驗(yàn)證超聲處理的效果。

免疫沉淀反應(yīng)

1. 將包含來自1×10⁷細(xì)胞的DNA的500μl細(xì)胞裂解液取出放入一個(gè)管中。

2. 在免疫沉淀之前，您需要設(shè)計(jì)四組實(shí)驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)組：將2-5μg特異性抗體加入500μl細(xì)胞裂解液中，并將管子放置在4℃旋轉(zhuǎn)混合器中過夜，形成抗原-抗體復(fù)合物。
輸入對(duì)照組：除了免疫沉淀反應(yīng)外，所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
陰性對(duì)照組：除了使用正常兔子IgG代替抗體外，所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
陽性對(duì)照組：除了使用組蛋白H3或RNA聚合酶II抗體代替抗體外，所有步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

3. 將50μl磁珠加入復(fù)合溶液中，在4℃下孵育2-4小時(shí)。

4. 將磁珠吸附在磁力架上，去除上清液。