1. 在Western blot中負載對照抗體的目的是什么?

估計每個泳道中加載的總蛋白質(zhì)量。這個信息是為了確定在不同樣本中感興趣蛋白質(zhì)水平的差異是否由于加載和轉(zhuǎn)移錯誤，還是由于蛋白質(zhì)表達的真實變化。

對Western blot過程進行故障排除。負載對照抗體可以幫助確定實驗過程中是否存在問題，并幫助確定可能的錯誤來源。

2. 在實驗中選擇合適的負載對照抗體的重要因素是什么?

如前所述，負載對照抗體是可以監(jiān)測整個檢測系統(tǒng)是否正常的參考對象，如蛋白質(zhì)提取過程、膜轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、顏色顯像系統(tǒng)等。也可用于比較不同條件下不同細胞組織中靶蛋白的表達。在選擇合適的載藥對照抗體作為內(nèi)參時，需要注意以下幾個方面。

樣本來源：在哺乳動物組織或細胞中，主要代表性的負載對照抗體有肌動蛋白、微管蛋白、GAPDH、Lamin B1和PCNA。但如果是植物樣本，主要代表性的負載對照抗體有肌動蛋白和GAPDH。

目標蛋白分子量：常見的負載對照抗體包括β肌動蛋白、β微管蛋白和GAPDH，它們的分子量分別為42 kDa、50 kDa和37 kDa。目標蛋白的分子量最好與內(nèi)部參考蛋白的分子量相差5 kDa以上，以便區(qū)分目標蛋白和內(nèi)部參考蛋白。

目標蛋白的表達位點：在不同的表達位點，基礎(chǔ)蛋白的特征不同。例如，微管蛋白、β肌動蛋白和GAPDH是全細胞蛋白，PCNA的定位在細胞核，Lamin B1位于核膜等。表格1總結(jié)了常見基礎(chǔ)蛋白的特點，包括名稱、類型和分子量。

表1. 常見管家蛋白的特征

3. 五種常見的負載對照抗體

在這部分中，我們列出了CUSABIO提供的五種常見的負載對照抗體。

3.1 Beta-Actin負載對照抗體

肌動蛋白是細胞的重要細胞骨架蛋白，可以大致分為六種類型。其中，四種肌動蛋白是特異性表達于不同肌肉組織中，而其他兩種則廣泛分布于各種組織中，包括β-肌動蛋白和γ-非肌肉肌動蛋白。β-肌動蛋白被認為是大多數(shù)組織和細胞的內(nèi)部參考基因。

β-肌動蛋白廣泛分布于細胞質(zhì)中，在所有細胞的總蛋白中豐度較高，約占總蛋白的50%。然而，在一些特殊情況下，如脂肪組織或細胞內(nèi)，β-肌動蛋白的表達量很低。它由375個氨基酸組成，分子量約為42-43 kDa。它適用于在WB實驗中檢測38kD-48kD大小的目標蛋白。但是，在脂肪組織中，β-肌動蛋白的表達量非常低，不適合作為內(nèi)部參考基因。

3.2 GAPDH負載對照抗體

GAPDH，也稱為糖酵解中的糖醛酸-3-磷酸脫氫酶，是參與糖酵解的關(guān)鍵酶。它由四個亞單位組成（每個亞單位約為30-40 kDa），其分子量約為146 kDa，檢測帶大約為36 kDa。GAPDH基因在幾乎所有組織中表達水平高，并且可以廣泛用作Western blot蛋白質(zhì)標準化的內(nèi)部參考基因。但請注意，在WB實驗中，它不適用于檢測30kD-40kD大小的目標蛋白。此外，在某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致GAPDH的表達增加，因此也不適合作為內(nèi)部參考基因。

3.3 β-Tubulin負載對照抗體

微管蛋白和肌動蛋白一樣，也是一種細胞骨架蛋白。微管蛋白可分為α、β、γ、δ、ε等多種微管蛋白。其中，α-Tubulin和β-Tubulin可形成異二聚體，是形成微管的兩種主要的Tubulin類型。α-微管蛋白和β-微管蛋白的相對分子質(zhì)量分別為55kDa和50kDa，其實際檢測條帶均在55kDa左右。

β-tubulin作為內(nèi)部參考，通常不會發(fā)生蛋白水平的變化，因此更廣泛地用于Western Blotting中樣品上樣是否一致的參考，并常用于免疫染色觀察細胞的微管結(jié)構(gòu)。但是，需要注意的是，對于50kD-60kD大小的目標蛋白不適合進行WB實驗。此外，在脂肪組織或細胞中，β- Tubulin很少表達，不適合作為內(nèi)部參考。

3.4 PCNA負載對照抗體

增殖細胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen，簡稱PCNA）最早于1978年由Miyachi在SLE（全身性紅斑狼瘡）患者的血清中發(fā)現(xiàn)并命名，僅在正常增殖細胞和腫瘤細胞中存在。PCNA是一種分子量為36kDa的蛋白質(zhì)，其在細胞核中合成，并存在于細胞核中，是DNA聚合酶的輔助蛋白。由于其在細胞核中的穩(wěn)定表達，其抗體被廣泛應用于核蛋白的內(nèi)部參考抗體中。

除了Histone H3和PCNA之外，其他常見的核蛋白內(nèi)部參考還包括K70、K80、Lamin A和B。在一些研究中，還使用Erk2、TATA結(jié)合蛋白（TBP）、c-Jun、c-Fos等。然而，除了考慮目標蛋白的分子量之外，選擇核蛋白內(nèi)部參考還需要考慮實際的實驗環(huán)境。例如，在涉及細胞增殖的實驗中，由于其自身表達的變化，c-Jun不適合作為內(nèi)部參考。在這種實驗中，TBP、Lamin等也不適合作為內(nèi)部參數(shù)。

3.5 COX IV負載對照抗體

細胞色素c氧化酶（Cytochrome c oxidase，簡稱COX）是線粒體呼吸鏈的酶復合物，是一個異源多聚酶，通常包含13個亞單位，位于線粒體內(nèi)膜上。形成細胞色素c氧化酶催化中心的三個最大的亞單位由線粒體DNA編碼，剩余的10個亞單位，包括COX IV，由細胞核內(nèi)的基因組DNA編碼。細胞色素c氧化酶（COX）活性缺陷與多種人類疾病相關(guān)。COX IV抗體可以用作線粒體蛋白質(zhì)加載的內(nèi)部參考抗體，目標蛋白的大小約為16 kDa。