制備抗體時(shí)抗原的選擇

一天之計(jì)在于晨，一年之計(jì)在于春。那么制備一個(gè)抗體，抗原的設(shè)計(jì)和表達(dá)系統(tǒng)的選擇則至關(guān)重要，可以毫不夸張的說(shuō)，設(shè)計(jì)出一個(gè)好的抗原對(duì)于制備一個(gè)高質(zhì)量抗體來(lái)說(shuō)就是成功了一大半。

設(shè)計(jì)抗原時(shí)，對(duì)抗原的結(jié)構(gòu)分析、B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)尤其重要。

1. 抗原的結(jié)構(gòu)分析

不同的蛋白類型，選擇的方法需要多樣性。大部分情況下，蛋白C端的親水性、表面可及性和柔性都相對(duì)N端較好。蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)也是預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位重要參數(shù)之一，β轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié)合，較可能成為抗原表位。而α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易變形，較難結(jié)合抗體，一般不作為抗原表位。含有5個(gè)以上的氨基酸殘基的轉(zhuǎn)角又常稱為環(huán)(loop)。以往的研究表明，蛋白表面的loop區(qū)可能為功能性抗體的識(shí)別位點(diǎn)，特異性好，可及性強(qiáng)。

Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)和CBS服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽、跨膜、表位等結(jié)構(gòu)；EX-PASY服務(wù)器(http://www.expasy.org/tools)上的GOR4、HNN、SOPMA、nnPredict等方法。親水性、柔韌性、表面可能性、抗原表位預(yù)測(cè)、α螺旋和β折疊可以應(yīng)用DNAstar軟件預(yù)測(cè)，同時(shí)可以結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)中的蛋白結(jié)構(gòu)分析。MOE軟件也可以預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)，同時(shí)MOE軟件可以從多個(gè)角度分析蛋白的結(jié)構(gòu)特性。

例如蛋白A：

1.1 信號(hào)肽分析時(shí)，表明該序列無(wú)信號(hào)肽

1.2 跨膜域分析，顯示該序列全部在胞外域

1.3 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

1.4 全長(zhǎng)蛋白各功能域劃分

1.5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，親水性，抗原性，表面可極性，柔性分析

2. B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的方法及應(yīng)用

線性表位的預(yù)測(cè)方法： B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)方法主要集中于線性表位，大量的預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位的算法都是基于蛋白質(zhì)序列。這些算法包括：蛋白質(zhì)的親水性算法、可及性算法、蛋白質(zhì)可塑性算法、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法、蛋白質(zhì)抗原性算法。這些方法的代表軟件有PEOPLE、PREDITOP、BEPITOPE、Bcepred、ABCpred、BepiPred、APP等。

構(gòu)象表位的預(yù)測(cè)方法：絕大多數(shù)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)方法都是基于蛋白質(zhì)的一級(jí)或二級(jí)結(jié)構(gòu)的，但這些方法只能用來(lái)預(yù)測(cè)由連續(xù)的氨基酸殘基構(gòu)成的線性表位，而基于蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)構(gòu)象表位的方法比較少，這是因?yàn)楦鞣N抗原的構(gòu)象表位可獲得的數(shù)據(jù)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于線性表位。

基于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)構(gòu)象表位的方法CEP：這是第一個(gè)以抗原蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)PDB文件作為輸入條件，以構(gòu)象性表位預(yù)測(cè)為主要目的的網(wǎng)上免費(fèi)服務(wù)軟件。由于抗原抗體之間的相互作用屬于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用中的一種，因此，可以參這些方法來(lái)預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。

分子對(duì)接：主要用來(lái)研究分子間的相互作用與識(shí)別，進(jìn)而預(yù)測(cè)復(fù)合物結(jié)構(gòu)。常用的分子對(duì)接軟件有ZDOCK、DOT、DOCK、ClusPro等。

3. 抗原的表達(dá)系統(tǒng)的選擇

通過(guò)對(duì)抗原的結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位分析預(yù)測(cè)后，然后再結(jié)合抗體的使用要求，進(jìn)行選擇適當(dāng)?shù)膮^(qū)間以及表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行抗原表達(dá)純化。

針對(duì)于簡(jiǎn)單的應(yīng)用WB\IHC\IF\IP這類的檢測(cè)應(yīng)用型的抗體，我們推薦的是蛋白的成熟的非跨膜區(qū)間，表達(dá)系統(tǒng)可以選擇大腸、酵母這種成功率高、經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)于較低的蛋白表達(dá)系統(tǒng)，抗體的類型可以選擇多抗和單抗。同時(shí)，這類型的抗體還可以選擇直接合成多肽偶聯(lián)載體后作為抗原，進(jìn)行免疫動(dòng)物。

如果是正對(duì)與IF、FC、細(xì)胞、抗體結(jié)合等實(shí)驗(yàn)的話，我們推薦的蛋白是全長(zhǎng)的或者成熟的跨膜和非跨膜區(qū)間，表達(dá)系統(tǒng)主要選擇無(wú)細(xì)胞、哺乳、酵母這類具有蛋白活性或者能表達(dá)出全長(zhǎng)的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)蛋白，對(duì)應(yīng)的抗體類型主要選擇單抗和基因工程抗體。

各種分析網(wǎng)站：

https://psort.hgc.jp/form2.html 亞細(xì)胞定位分析

http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/ 信號(hào)肽分析

http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv_submit.html 跨膜分析

https://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html 線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)肽分析

http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi 核定位分析

http://www.proteinatlas.org/ 表達(dá)預(yù)測(cè)（人種屬）

https://bgee.org/?page=gene 表達(dá)豐度預(yù)測(cè)

http://old.protein.bio.unipd.it/espritz/ 結(jié)構(gòu)無(wú)序性分析

https://swissmodel.expasy.org/ 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 糖基化修飾預(yù)測(cè)分析

https://www.ebi.ac.uk/interpro/ 功能預(yù)測(cè)分析