流式細胞術（FC）方案
原理
流式細胞術是一種高效的細胞分析技術，它可以對單個細胞進行快速、準確的分析和分類。該技術的原理是將細胞懸浮在液體中，通過流式細胞儀對細胞進行檢測和分析。
流式細胞儀是一種高科技儀器，它可以將細胞懸浮液通過微細管道引入儀器中，然后通過激光束對細胞進行檢測。激光束照射到細胞上時，會產(chǎn)生散射光和熒光信號。這些信號可以被流式細胞儀捕捉并記錄下來。流式細胞術的原理是基于細胞的特性進行分類和分析。細胞的特性包括大小、形狀、表面分子、細胞器、染色體等。通過對這些特性的分析，可以對細胞 進行分類和鑒定。
流式細胞術可以用于許多不同的應用，包括細胞分析、細胞排序、細胞計數(shù)、細胞增殖等。例如，在癌癥研究中，流式細胞術可以用于檢測癌細胞的數(shù)量和類型，以及評估治療效果。在免疫學研究中，流式細胞術可以用于檢 測免疫細胞的數(shù)量和功能。
流式細胞術的優(yōu)點是快速、準確、高通量和高靈敏度。它可以對大量的細胞進行分析，并且可以檢測到非常低濃度的細胞。此外，流式細胞術還可以對細胞進行多參數(shù)分析，即同時檢測多個細胞特性。
用途
通過對細胞的特性進行分析和分類，可以更好地理解細胞的功能和疾病的發(fā)生機制。
步驟
1. 樣品準備
● 細胞樣品的制備
(1) 對于懸浮細胞，以1000rmp 離心收集細胞；對于貼壁細胞，用胰蛋白酶消化細胞，并1000rmp 離心收集貼壁細胞。細胞密度需達到1*106。
(2) 用預冷的PBS 沖洗細胞3次；
● 組織樣品的制備
(1) 通過胰酶或膠原酶剪切組織和消化組織腫塊。
(2) 在顯微鏡下觀察單個分散細胞并終止消化。胰酶通常用于消化間質(zhì)較 少的組織，而膠原酶則用于有膠原結構的組織。 一般胰酶作用時間為 20-60min, 而膠原酶作用時間為4-48h。
2. 固定和滲透作用
樣品的固定和滲透過程是決定實驗成功與否的關鍵。交聯(lián)劑(如4%甲醛、 10%福爾馬林和戊二醛)和變性劑(如70%乙醇和90%乙醇)常被用作固定劑。交聯(lián)試劑與細胞蛋白交聯(lián)，變性試劑與膜反應并破膜。因此，如果使用變性試劑進行固定，則不需要對細胞內(nèi)蛋白進行滲透標記。但必須將0.2% TritonX-100 交聯(lián)試劑固定在標記的細胞內(nèi)蛋白上進行滲透。如果目標蛋白是膜蛋白，則不需要滲透。
(1)70%乙醇4℃固定12h(-20℃ 保存1個月)或4%甲醛室溫固定15min, 0.2% TritonX-100滲透5min(4℃ 保存1周)。如果目標蛋白位于膜上，則 可以忽略其固定。對于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，需要固定。
(2)1000rpm 離心，PBS 洗三次。
3. 封閉
這一過程是為了減少抗體與其他非特異性蛋白質(zhì)之間的非特異性結合。常用10%正常山羊血清作為阻斷液(品種必須與二抗一致)。
4. 抗體孵育
(1) 根據(jù)推薦的稀釋比例制備一抗溶液。
(2) 一抗4℃孵育過夜。當用到正常兔或小鼠 |gG 時，我們需要設置陰性對照。
(3) 用PBS 沖洗細胞三次。
(4) 在暗處按照推薦的稀釋比例配制二抗溶液。
(5) 二抗4℃孵育30min。
(6) 用PBS 沖洗細胞三次。
(7) 用500 μl PBS重懸檢測。
5. 檢測
將樣品置于黑暗中，盡快用流式細胞儀檢測熒光信號。
常見問題
1. 怎么選擇合適的對照?
(1) 同型對照：使用同型抗體做平行實驗，主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結合。
(2) 陰性細胞對照：使用已知的不表達目標抗原的細胞做平行實驗，主要目的是消除抗體的非特異性結合。
(3) 二抗對照：第二抗體多為熒光標記的多抗，非特異性結合一般較高，可能造成基礎熒光值偏高，設立二抗對照平行實驗的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
(4) 陽性對照： 一般會使用已知的高表達目標抗原的細胞做平行實驗，主要目的是排除實驗中實驗方法、試劑、操作等實驗的影響因素。
(5) 空白對照：不進行任何標記的細胞，主要目的是用于測定基礎熒光信號 表達值。
2. 收集的細胞通過流式儀檢測時， 一般多少的細胞量合適?
進行流式檢測時，至少需要記錄5000個活細胞， 一般調(diào)整細胞密度至 1*10'/100ul 進行流式檢測。
3. FCM 檢測過程中如何設門(gating)?
一般根據(jù)散射光進行設門，即我們通常所說的前散(forward scatter, FSC) 和側(cè)散(side scatter, SSC)來設門。FSC 的大小與細胞的直徑成正相關，不 同的細胞，細胞越大，其FSC 越大；反之越小。SSC 的大小與細胞內(nèi)顆粒結構的質(zhì)量成正相關，不同的細胞，細胞內(nèi)顆粒結構越復雜，質(zhì)量越大，其SSC 越大；反之越小。
4. FCM 檢測過程中如何調(diào)節(jié)補償?
在FCM檢測過程中，如果存在多色，則必須進行熒光補償調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)補償首先要知道雙陰性細胞的情況，其次，必須要用單陽和雙陰性細胞。只有在有陰性細胞作為參照的情況下，才能既不會過多又不會過少地調(diào)節(jié)補償。
5. FCM 檢測時，每次實驗的細胞數(shù)一定要相同嗎?
FCM 檢測時，若不進行細胞計數(shù)而憑感覺隨意進行實驗會直接影響實驗結 果。當細胞量多而抗體量不變或細胞量不變而抗體量減少，那么熒光抗體平均分布到每個陽性細胞上的量就會相對減少。由此可見，不同的細胞量會影響最終的實驗結果。因此，在準備樣本時，必須進行細胞計數(shù)，使每個分組及每次實驗的細胞數(shù)保持一致。
6. FCM 檢測時，如果存在多色分析，應該如何進行配色呢?
在FCM 檢測過程中，如果存在多色分析，雖然可以通過熒光補償來消除熒光光譜重疊的影響。但調(diào)節(jié)補償過大在一定程度上仍然會影響測值的準確性，因此，我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。
