蛋白常見問(wèn)題及解答
Q: 什么是蛋白表達(dá)和純化？
蛋白表達(dá)是一種生物技術(shù)過(guò)程，用于產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)。它可以在原核生物、真核生物或體外大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行。蛋白純化是一系列旨在從細(xì)胞或生物體中分離出一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)的過(guò)程。蛋白質(zhì)純化的最常用方法是親和層析，它通過(guò)不同的蛋白質(zhì)標(biāo)簽進(jìn)行設(shè)計(jì)。其他蛋白質(zhì)純化方法包括離子交換層析、分子排阻層析、拋光純化和疏水相互作用層析，可用于處理高純度的無(wú)標(biāo)簽蛋白質(zhì)。
Q: 蛋白質(zhì)是如何純化的？純度是否有保證？
根據(jù)融合蛋白的標(biāo)簽類型和蛋白質(zhì)本身的理化特性設(shè)計(jì)最佳純化方案。常用的純化方法包括：親和層析、疏水層析、離子交換層析、分子篩、鹽析等。我們保證的最低純度標(biāo)準(zhǔn)為〉85%。如果初始純化未達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)或客戶有更高的純度要求，我們還擁有AKATA純化儀器，該儀器高度自動(dòng)化、精確控制，結(jié)合使用各種柱子，確保我們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純度進(jìn)一步提高，并在COA報(bào)告上顯示最終純度測(cè)試結(jié)果。
雖然我們保證的最低純度標(biāo)準(zhǔn)為>85%，但我們制備的一些蛋白質(zhì)的純度達(dá)到了95%甚至97%。
Q: 為什么沒(méi)有或蛋白表達(dá)量很低？
可能存在的原因有：
a. 向量構(gòu)建錯(cuò)誤。您應(yīng)該通過(guò)測(cè)序確認(rèn)向量或申請(qǐng)CUSABIO定制克隆服務(wù)。
b. 稀有密碼子。你應(yīng)該優(yōu)化密碼子，使用補(bǔ)充稀有密碼子的菌株，在較低的溫度下誘導(dǎo)或在較差的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)
c. 蛋白質(zhì)毒性。您應(yīng)該使用調(diào)控更嚴(yán)格的啟動(dòng)子或較低的質(zhì)粒拷貝數(shù)。在基于T7系統(tǒng)的菌株中使用pLysS/pLysE菌株，或者選擇更適合表達(dá)毒性蛋白質(zhì)的菌株。在高OD值下開始誘導(dǎo)并縮短誘導(dǎo)時(shí)間。在使用含有Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體時(shí)添加葡萄糖。
Q: 如何表達(dá)具有生物活性的蛋白質(zhì)？為什么蛋白質(zhì)無(wú)活性？
為了獲得具有生物活性的蛋白質(zhì)，您應(yīng)選擇正確的表達(dá)系統(tǒng)、適當(dāng)?shù)乇磉_(dá)載體、合適的純化方法以及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此外，您還可以檢查以下問(wèn)題：
a. 蛋白質(zhì)的溶解度較低。您可以將所需的蛋白質(zhì)與融合伴侶融合，并降低溫度。
b. 缺乏必要的翻譯后修飾。您應(yīng)選擇另一個(gè)表達(dá)系統(tǒng)。
c. 折疊不完整。您應(yīng)使用融合伴侶，并使用具有冷適應(yīng)分子伴侶的菌株。在較低溫度下與分子伴侶共同表達(dá)。監(jiān)測(cè)二硫鍵的形成，并允許進(jìn)一步的體外折疊。
d. cDNA中的突變。您應(yīng)在誘導(dǎo)前后測(cè)序質(zhì)粒，或使用recA－菌株確保質(zhì)粒的穩(wěn)定性。在每次表達(dá)循環(huán)前轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
Q: 如何避免包涵體的形成并改善可溶性表達(dá)？
a. 高親水性或跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。您應(yīng)該添加融合標(biāo)簽或加入熱休克分子伴侶。在低溫下較短時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)，或者轉(zhuǎn)換至貧負(fù)載培養(yǎng)基。產(chǎn)生截短形式的蛋白質(zhì)或使用富含膜的菌株。
b. 錯(cuò)誤的二硫鍵形成。您應(yīng)該添加融合伴侶蛋白，包括巰基還原酶、DsbA和DsbC。克隆到含有分泌信號(hào)肽的質(zhì)粒中，使其分泌到細(xì)胞外腔。使用具有氧化型胞質(zhì)環(huán)境的gamiB (DE3）菌株。降低誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度。
c. 錯(cuò)誤的折疊。您應(yīng)該使用融合伴侶蛋白。與分子伴侶一同共表達(dá)。使用具有冷適應(yīng)分子伴侶的菌株。向培養(yǎng)基中添加化學(xué)分子伴侶和輔因子。降低誘導(dǎo)劑濃度并添加新鮮培養(yǎng)基。在低溫下較短時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)。
Q: 為什么蛋白質(zhì)的分子量小于預(yù)測(cè)值？
可能存在的原因有：
a. 蛋白質(zhì)序列中包含罕見的氨基酸硒蛋白質(zhì)（Sec）或吡咯賴氨酸（Pyl）。您應(yīng)該使用其他氨基酸來(lái)代替這兩種不常見的氨基酸。
b. 融合蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程不平衡。您應(yīng)該更換其他的融合標(biāo)簽或?qū)⑷诤蠘?biāo)簽移到C端。在低溫下較短時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)，或者轉(zhuǎn)換至貧負(fù)載培養(yǎng)基。
c. 蛋白質(zhì)降解。您應(yīng)該替換特定的蛋白酶位點(diǎn)。使用蛋白酶缺陷菌株。在高光密度下誘導(dǎo)表達(dá)。在低溫下較短時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)，或者在破碎細(xì)胞時(shí)使用蛋白酶抑制劑。
Q: 為什么實(shí)際的帶狀大小與預(yù)測(cè)值不同？
可能存在的原因有：
a. 翻譯后修飾。如磷酸化、糖基化等會(huì)增加蛋白質(zhì)的大小。
b. 翻譯后剪切。許多蛋白質(zhì)首先合成為前蛋白質(zhì)，然后通過(guò)剪切產(chǎn)生活性形式。
c. 剪接變體。剪接變異可能從同一基因產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。
d. 相對(duì)電荷。氨基酸的組成具有不同的相對(duì)電荷，這會(huì)影響電泳遷移性。
e. 多聚體，例如蛋白質(zhì)的二聚化。通常在還原條件下會(huì)被阻止，盡管強(qiáng)烈的相互作用可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)較高的帶狀。
f. 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如二硫鍵、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)形成。
g. 疏水性蛋白質(zhì)，如跨膜蛋白質(zhì)，可能難以遷移到凝膠中，從而導(dǎo)致不同的多帶圖案。
Q: 如何重溶和儲(chǔ)存產(chǎn)品？
在打開蓋子之前，請(qǐng)先離心試劑管。
對(duì)于短期儲(chǔ)存或使用，請(qǐng)使用無(wú)菌去離子水將蛋白質(zhì)完全重溶至0.1-1.0 mg/mL。如有需要，重溶后經(jīng)過(guò)10—15分鐘后進(jìn)行分裝，并儲(chǔ)存在4℃。
對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存，建議將細(xì)胞因子或重組蛋白添加5%-50%的甘油（最終濃度），并進(jìn)行分裝以長(zhǎng)期儲(chǔ)存在-20℃/-80℃。我們默認(rèn)的甘油最終濃度為50%。客戶可以參考此濃度。
Q: CUSABIO使用哪些類型的標(biāo)簽進(jìn)行融合？
CUSABIO提供的常見標(biāo)簽包括His-tag、FLAG-tag、GST-tag、MBP-tag、組合標(biāo)簽（His-GST-tag、His-sumo-tag、His-MBP-tag）等。有時(shí)，在制造過(guò)程中會(huì)確定蛋白質(zhì)的標(biāo)簽類型。如果您有指定的標(biāo)簽類型，請(qǐng)隨時(shí)與我們咨詢。
Q: 給定的標(biāo)簽類型會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的生物活性產(chǎn)生什么影響？
從理論上講，小的標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)活性影響很小。然而，具體對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響無(wú)法一概而論（有些蛋白質(zhì)沒(méi)有影響，有些蛋白質(zhì)有輕微影響，而有些蛋白質(zhì)可能有較大影響）。
Q: CUSABIO能去除內(nèi)毒素嗎？
并非所有的內(nèi)毒素都可以去除。如果您需要去除內(nèi)毒素，請(qǐng)?zhí)崆芭c我們溝通，該過(guò)程需要2～3個(gè)工作日。我們可以提供免費(fèi)的內(nèi)毒素去除服務(wù)，使用PMB親和層析法，并使用LAL試劑進(jìn)行半定量檢測(cè)，確保內(nèi)毒素水平在0.1 ng/μg（1 EU/μg）以內(nèi)。
Q: CUSABIO能提供無(wú)菌生產(chǎn)加工嗎？
是的，我們可以提供這項(xiàng)服務(wù)，而且是免費(fèi)的，但您需要在下訂單時(shí)備注此信息。我們?cè)趦龈芍皩?duì)液體蛋白進(jìn)行了無(wú)菌處理，但在凍干過(guò)程中可能存在污染，因此無(wú)法保證整個(gè)過(guò)程是無(wú)菌的。
Q: 如何確定細(xì)胞因子的物種交叉反應(yīng)性？
a. 除了少數(shù)例外情況外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子在小鼠細(xì)胞上具有活性。
b. 許多小鼠細(xì)胞因子也可能對(duì)人類細(xì)胞產(chǎn)生影響，但其活性可能低于相應(yīng)的人類細(xì)胞因子。
c. 少數(shù)人類細(xì)胞因子在作用于小鼠細(xì)胞時(shí)會(huì)比相應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子更活躍，例如IL-7。
d. 干擾素、GM-CSF、IL-3和IL-4等細(xì)胞因子是物種特異性的，幾乎對(duì)非同源細(xì)胞沒(méi)有活性。
e. 相比之下，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在不同物種的細(xì)胞上都具有良好的活性，它們高度保守。
Q: 通常使用的防腐劑是什么？通常添加哪種防腐劑？
常用的防腐劑包括Proclin 300、偶氮甲烷等。我們的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不添加任何防腐劑。
Q: 蛋白為什么要凍干？?jī)龈蓪?duì)蛋白的影響有哪些？
蛋白質(zhì)對(duì)熱敏感，凍干能使絕大部分蛋白質(zhì)的活性保留下來(lái)，提高蛋白的穩(wěn)定性并延長(zhǎng)保存時(shí)間，同時(shí)降低運(yùn)費(fèi)。
凍干有可能會(huì)造成蛋白的活性部分損失，聚集和其它變性問(wèn)題。但可以通過(guò)添加保護(hù)劑（穩(wěn)定劑，添加劑，輔料）和控制凍干的各種條件來(lái)盡可能降低這些負(fù)面的影響。
溫馨提示：武漢華美提供的蛋白產(chǎn)品一般為凍干粉，它們?cè)谑覝貤l件下非常穩(wěn)定(至少1個(gè)月)。盡管如此，我們還是建議您在收到我們的產(chǎn)品后保存于-20℃ ，以確保蛋白100%的活性。
Q: 凍干前為什么向蛋白溶液中加保護(hù)劑？一般凍干保護(hù)劑有哪幾種？你們的產(chǎn)品通常加的保護(hù)劑是什么？
保護(hù)劑是用來(lái)在凍干和儲(chǔ)存過(guò)程中保護(hù)蛋白的。常用的保護(hù)劑或穩(wěn)定劑有糖類，多元醇，聚合物，表面活性劑，某些蛋白和氨基酸等。我們通常加8%（質(zhì)量比體積）的海藻糖和甘露醇作為凍干保護(hù)劑。海藻糖可明顯阻止蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)改變以及凍干過(guò)程中蛋白質(zhì)的伸展和聚集；甘露醇也是一種普遍應(yīng)用的凍干保護(hù)劑和填充劑，可以降低某些蛋白的凍干后聚集情況。
溫馨提示：對(duì)于大多數(shù)蛋白，重懸后在4℃僅能短期保存(約1周)。如想長(zhǎng)期保存，請(qǐng)先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白，如0.1% BSA，5%HSA，或10% FBS)，然后分裝凍存于-20℃或-80℃。一定要避免反復(fù)凍融，因每次凍融均會(huì)引起蛋白的部分失活。
Q: 為什么我的管內(nèi)幾乎看不見蛋白產(chǎn)品？
CUSABIO的蛋白產(chǎn)品中不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)和蔗糖等，并以最低含鹽量的溶液進(jìn)行凍干時(shí)，常常不能形成白色網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而是微量的蛋白在凍干過(guò)程中沉積在管內(nèi)，形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。
溫馨提示：在打開管蓋前，我們建議您在小離心機(jī)中快速離心20-30秒，使附著在管蓋或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質(zhì)控步驟保證每管中所含的蛋白量準(zhǔn)確無(wú)誤，雖然有時(shí)您無(wú)法看到蛋白粉末，但管中的蛋白含量仍是非常精確的。
Q: 應(yīng)如何確定細(xì)胞因子的種屬交叉活性？
1) 除少數(shù)例外，大多數(shù)人類細(xì)胞因子對(duì)小鼠細(xì)胞均有活性。2) 許多小鼠細(xì)胞因子也可作用于人類細(xì)胞，但比活性可能低于對(duì)應(yīng)的人類細(xì)胞因子。 3) IL-7等為數(shù)不多的人類細(xì)胞因子作用于小鼠細(xì)胞時(shí)比對(duì)應(yīng)的小鼠細(xì)胞因子活性更強(qiáng)。4) 干擾素，GM-CSF, IL-3和IL-4等細(xì)胞因子種屬特異，對(duì)非同源細(xì)胞幾乎沒(méi)有活性。5) 相反，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGFs)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophins)高度保守，在不同動(dòng)物種屬細(xì)胞上均具有很好的活性。
Q: 應(yīng)如何正確溶解重組蛋白產(chǎn)品？
第1步：開蓋前離心試劑管。凍干粉在運(yùn)輸過(guò)程中可能會(huì)因顛簸而漂散并粘貼于管壁或管蓋上，所以在打開塑料瓶蓋前，需將凍干粉通過(guò)離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。一般需要3000-3500rpm離心5min，效果良好。
第2步：用無(wú)菌水重懸至0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。這個(gè)步驟即為溶解步驟，非常重要。
1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉。蛋白的溶解性與很多因素有關(guān)，其中比較重要的是pH值和離子強(qiáng)度。產(chǎn)品說(shuō)明上所標(biāo)明的溶解液是能夠?qū)⒃摷?xì)胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的pH值和離子強(qiáng)度與說(shuō)明書中所標(biāo)明的不符，很多時(shí)候會(huì)造成細(xì)胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無(wú)法溶解，這樣所配得的細(xì)胞因子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。
2) 一定要溶解到指定的濃度。蛋白在一定的濃度范圍內(nèi)可以保持良好的穩(wěn)定性，這個(gè)范圍就是說(shuō)明書上所標(biāo)明的濃度范圍，一般為0.1-1.0 mg/ml。但這一濃度范圍對(duì)于不同的重組蛋白是不同的。高于或低于該濃度范圍時(shí)細(xì)胞因子或蛋白會(huì)不穩(wěn)定，即很容易出現(xiàn)活性下降的現(xiàn)象。其次，高于這個(gè)濃度范圍，可能會(huì)超過(guò)該蛋白的最大溶解濃度，即蛋白無(wú)法完全溶解。再者，高于或低于該濃度范圍，蛋白可能會(huì)出現(xiàn)聚集(aggregation)，最終結(jié)果還是部分蛋白未溶解，導(dǎo)致蛋白活性的減弱。
3) 一定不能振蕩(vortex)。這里所說(shuō)的振蕩是指用渦旋儀進(jìn)行快速振蕩。請(qǐng)用放至室溫的緩沖液作為溶劑。加緩沖液后，蓋好瓶塞，輕輕用手翻轉(zhuǎn)瓶子或把瓶子放在一個(gè)緩慢搖擺的搖床上。這樣做來(lái)保證緩沖液能夠接觸到瓶子的整個(gè)內(nèi)壁。 讓瓶子在室溫放置至少10 - 15分鐘，然后可以進(jìn)行分裝或使用。
第3步：該重懸液在2-8℃最長(zhǎng)可保存1周。
用說(shuō)明書上推薦的溶液將細(xì)胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后，細(xì)胞因子或重組蛋白可放置在2-8℃，即冰箱的冷藏室。在這種條件下，細(xì)胞因子或重組蛋白的活性最長(zhǎng)可保持1周。這對(duì)一個(gè)周期為5-7天的實(shí)驗(yàn)，如DC(樹突狀細(xì)胞)的誘導(dǎo)成熟是足夠的。在此期間，只要每次從冰箱里吸取一定量的細(xì)胞因子或重組蛋白溶液加入到培養(yǎng)體系內(nèi)即可。
其實(shí)，說(shuō)明書上推薦的濃度對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)來(lái)講是比較高的。所以用戶通常會(huì)將該溶液進(jìn)一步稀釋后再放在4℃保存，待1周內(nèi)用完。如進(jìn)行稀釋，必須遵照下面第4步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進(jìn)行稀釋，否則稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白很容易會(huì)粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細(xì)胞因子或重組蛋白的濃度下降，細(xì)胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。
第4步：如要長(zhǎng)期保存，則需用含載體蛋白(如0.1% BSA，或10% FBS，或5% HSA)的溶液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃。
如果一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)于一周，或配制的細(xì)胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對(duì)細(xì)胞因子或重組蛋白進(jìn)行長(zhǎng)期保存。方法是：將已重懸的細(xì)胞因子或蛋白用含載體蛋白，如0.1% BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白)的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋，然后分裝凍存于-20℃至-80℃，即常規(guī)冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。
在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進(jìn)一步稀釋。稀釋后的細(xì)胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大量的載體蛋白可以保證低濃度細(xì)胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩(wěn)定性。
即在做無(wú)血清培養(yǎng)或動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞因子中不能含有BSA，F(xiàn)BS或HSA等動(dòng)物或人的蛋白，要想長(zhǎng)期保存細(xì)胞因子或重組蛋白則可用海藻糖(Trehalose)作為載體，用含海藻糖的溶液來(lái)稀釋已重懸的細(xì)胞因子或重組蛋白，然后分裝凍存。
