1. “銅死亡”

TODD R研究團(tuán)隊(duì)揭示的“銅死亡”是一種全新的、受調(diào)控的細(xì)胞死亡方式。銅離子直接結(jié)合三羧酸（TCA）循環(huán)中的硫辛酰化組分，導(dǎo)致硫辛酰化蛋白的異常聚集，F(xiàn)e-S簇蛋白表達(dá)下降，從而引起蛋白毒性應(yīng)激反應(yīng)并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

這意味著可以針對相關(guān)分子，制定出一套更有效的銅離子載體治療方案，特別是針對FDX1、硫辛酰化水平高，依賴線粒體呼吸的腫瘤類型。因此，“銅死亡”作為最新提出的一種細(xì)胞死亡機(jī)制，引起學(xué)術(shù)界的振奮！

2.“銅死亡”調(diào)節(jié)機(jī)制

通過TODD R團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果部分，我們可以了解到銅離子載體導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制，具體結(jié)果分析過程如下：

1）銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是新型的細(xì)胞死亡

首先研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，銅離子載體均能殺傷細(xì)胞，且使用銅離子載體Elesclomol，可調(diào)控銅介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。那這種死亡方式，是否區(qū)別于已知的死亡方式（細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、鐵死亡）？為了進(jìn)一步驗(yàn)證，團(tuán)隊(duì)通過敲除凋亡關(guān)鍵效應(yīng)因子Bax和BAK1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未能阻止銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，說明其細(xì)胞死亡機(jī)制明顯不同于已知的細(xì)胞死亡途徑。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是一種全新的細(xì)胞死亡形式。

圖1. 銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是新型的細(xì)胞死亡 ^[1]

2）線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡

緊接著，TODD R團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸在這種死亡機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，當(dāng)細(xì)胞依賴于線粒體呼吸時(shí)，其對銅離子載體的敏感性比進(jìn)行糖酵解細(xì)胞高近1千倍；使用線粒體抗氧化劑、脂肪酸以及線粒體功能抑制劑處理細(xì)胞，會顯著影響細(xì)胞對銅離子載體的敏感性。

此外，線粒體解聚物FCCP對銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡沒有影響；隨后團(tuán)隊(duì)檢測了細(xì)胞不同類型的缺氧刺激，與銅離子載體處理對細(xì)胞耗氧率（OCR）的影響，數(shù)據(jù)表明，銅不會直接針對電子傳遞鏈（ETC），而是只在三羧酸（TCA）循環(huán)中發(fā)揮作用。這些論證表明，銅誘導(dǎo)細(xì)胞死亡所必需的是線粒體呼吸。

圖2. 線粒體呼吸調(diào)節(jié)銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 ^[1]

3）FDX1與蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)

為進(jìn)一步明確細(xì)胞死亡的代謝路徑，研究團(tuán)隊(duì)使用了全基因組CRISPR-Cas9功能缺失篩選，并采用不同結(jié)構(gòu)的銅離子載體進(jìn)行處理，以提高篩選的普遍性。團(tuán)隊(duì)對3千種代謝酶進(jìn)行獨(dú)立的敲除篩選。

從以上的篩選中，他們找到了七個(gè)正調(diào)控基因（FDX1、LIAS、LIPT1、DLD、DLAT、PDHA1和PDHB）以及三個(gè)負(fù)調(diào)控基因（MTF1、GLS和CDKN2A），其中鐵氧還蛋白 1基因（ferredoxin 1，F(xiàn)DX1）和蛋白質(zhì)硫辛酰化（Protein lipoylation）是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。通過個(gè)別基因敲除研究，缺失FDX1和硫辛酸合酶基因（lipoic acid synthase，LIAS）可增強(qiáng)對銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗力，進(jìn)一步說明FDX1和蛋白硫辛酰化與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡之間的功能聯(lián)系。這些研究表明，F(xiàn)DX1與蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)。

圖3. FDX1與蛋白硫辛酰化是銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì) ^[1]

4）FDX1是蛋白硫辛酰化的上游調(diào)控因子

進(jìn)一步的，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，敲除FDX1或硫辛酰化相關(guān)酶均可以保護(hù)細(xì)胞免遭銅毒性，因此，他們提出猜想，F(xiàn)DX1可否為蛋白質(zhì)硫辛酰化的上游調(diào)節(jié)因子？通過癌癥依賴性圖譜(Cancer Dependency Map)等公共數(shù)據(jù)庫，他們發(fā)現(xiàn)FDX1和硫辛酰化相關(guān)酶與細(xì)胞存活高度相關(guān)。

隨后，他們對208例人類腫瘤標(biāo)本進(jìn)行FDX1和硫辛酸途徑蛋白的免疫組化（IHC）染色分析，結(jié)果顯示FDX1和硫辛酰化蛋白的表達(dá)高度相關(guān)；WB實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步確認(rèn)了FDX1的敲除會導(dǎo)致二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰基酶基因（Dihydrolipoamide S-Acetyltransferase，DLAT）和二氫硫辛酰胺S-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶（DLST，Dihydrolipoamide S-Succinyltransferase）的蛋白硫辛酰化缺失；通過代謝物分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1的缺失會導(dǎo)致丙酮酸和α-酮戊二酸的積累，琥珀酸的消耗，以及LIAS的關(guān)鍵底物S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的積累。以上數(shù)據(jù)證實(shí)，F(xiàn)DX1參與調(diào)節(jié)蛋白的硫辛酰化過程。

圖4. FDX1是蛋白硫辛酰化的上游調(diào)控因子 ^[1]

5）銅直接結(jié)合硫辛酰化DLAT并誘導(dǎo)其寡聚化

通過前面的實(shí)驗(yàn)，作者建立了銅死亡和蛋白質(zhì)脂酰化之間的聯(lián)系，但只是間接證實(shí)FDX1和硫辛酰化的蛋白在銅死亡中的重要性，沒有建立直接的機(jī)制聯(lián)系。那么，銅是否直接與脂酰化蛋白質(zhì)結(jié)合呢？

為此，研究團(tuán)隊(duì)在FDX1敲除細(xì)胞與正常細(xì)胞的裂解液中純化出DLAT和DLST兩種蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞中的DLAT和Lip-DLST（硫辛酰化狀態(tài)），會直接與銅離子結(jié)合，但不與鈷或鎳樹脂結(jié)合。而FDX1敲除細(xì)胞中的DLAT和DLST（去硫辛酰化狀態(tài)）則不與銅結(jié)合，表明蛋白的硫辛酰化修飾，是直接結(jié)合銅的必要條件。

此外，對Elesclomol敏感細(xì)胞的處理會增加DLAT寡聚體的水平，而對Elesclomol不敏感細(xì)胞系或FDX1敲除處理，只有在Elesclomol高濃度下才能導(dǎo)致DLAT寡聚。通過質(zhì)譜分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，銅離子載體處理還可導(dǎo)致Fe-S簇蛋白的水平降低。以上數(shù)據(jù)表明，銅直接結(jié)合硫辛酰化DLAT并誘導(dǎo)其寡聚化。

圖5. 銅直接結(jié)合硫辛酰化DLAT并誘導(dǎo)其寡聚化 ^[1]

6）銅過量導(dǎo)致的細(xì)胞死亡機(jī)制與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制是同一種機(jī)制

研究到這兒，通過以上1-5的驗(yàn)證，銅死亡的機(jī)制已揭曉：銅離子載體誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)銅離子水平上升至超過閾值，過量的銅促進(jìn)硫辛酰化蛋白聚集，并使Fe-S簇蛋白不穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白毒性應(yīng)激增高，最后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。但是，團(tuán)隊(duì)再次提出疑問：銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與自然發(fā)生的銅穩(wěn)態(tài)功能障礙是否是同一種分子機(jī)制導(dǎo)致？

為探索其潛在聯(lián)系，研究者首先在人胚胎腎HEK 293T和ABC1細(xì)胞中過表達(dá)銅運(yùn)載體SLC31A1（銅穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵靶點(diǎn)），數(shù)據(jù)表明，銅輸入顯著增強(qiáng)了細(xì)胞對線粒體呼吸相關(guān)蛋白的總消耗，導(dǎo)致蛋白硫辛酰化減少，F(xiàn)e-S簇蛋白水平降低，HSP70應(yīng)激蛋白水平升高。

更值得關(guān)注的是，過表達(dá)SLC31A1的細(xì)胞中，鐵死亡、壞死性凋亡、凋亡抑制劑和抗氧化劑，均都不能阻止銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但銅螯合劑、FDX1 Knockdown和LIAS Knockdown卻可以減輕細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

最后，研究者采用Wilson's disease小鼠模型發(fā)現(xiàn)，老年Atp7b缺陷小鼠的肝臟中，蛋白的硫辛酰化水平和Fe-S簇蛋白的含量，均顯著降低，Hsp70蛋白則升高。通過多種模型分析，基因誘導(dǎo)下的銅過量導(dǎo)致的細(xì)胞死亡機(jī)制與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制是同一種機(jī)制。

圖6. 銅過量導(dǎo)致的細(xì)胞死亡機(jī)制與銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制是同一種機(jī)制 ^[1]

3.“銅死亡”相關(guān)熱門靶點(diǎn)

目前該研究中，作者主要發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與“銅死亡”代謝途徑特異性相關(guān)的調(diào)節(jié)基因。這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在“銅死亡”過程中的具體作用，以及銅毒性治療癌癥的有效性將是未來的研究熱點(diǎn)。

華美生物匯總了當(dāng)前與“銅死亡”相關(guān)信號通路中，大部分熱門靶點(diǎn)抗體產(chǎn)品，點(diǎn)擊靶點(diǎn)對應(yīng)貨號可查看相關(guān)試劑（具體詳情見下表）。

“銅死亡”熱門靶點(diǎn)抗體產(chǎn)品匯總：

參考文獻(xiàn)：

1. Tsvetkov, Peter, et al. "Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins." Science 375.6586 (2022): 1254-1261.