流式抗體的 “同型對照” 作用是什么?選擇同型對照時需要注意哪些匹配條件?
日期:2025-12-19 13:48:11
流式抗體的同型對照是流式細胞術實驗中用于判斷抗體非特異性結合、設定陰性閾值的關鍵對照試劑,其核心作用是排除實驗中因抗體Fc段與細胞表面Fc受體結合、蛋白間靜電吸附等造成的假陽性信號,確保檢測到的熒光信號是抗體與靶抗原的特異性結合。
一、同型對照的核心作用
2、校準流式檢測的陰性門(陰性群體)
3、評估實驗背景噪音
二、選擇同型對照的關鍵匹配條件
3、無同型對照匹配時的替代方案
一、同型對照的核心作用
1、區分特異性結合與非特異性結合
同型對照抗體不識別靶細胞上的任何抗原,僅保留與目標抗體一致的免疫球蛋白骨架結構。將同型對照的熒光信號作為基線閾值,目標抗體信號超過該閾值的部分,即可判定為特異性結合信號。
例:檢測CD3陽性T細胞時,若目標抗體(鼠IgG1抗人CD3-PE)的熒光信號顯著高于同型對照(鼠IgG1-PE),則說明信號來自CD3抗原的特異性結合。
2、校準流式檢測的陰性門(陰性群體)
在流式設門時,需以同型對照染色的細胞群體為參照,劃定陰性細胞的熒光強度范圍,避免將非特異性結合的細胞誤判為陽性細胞,尤其適用于低表達抗原的檢測。
3、評估實驗背景噪音
同型對照的熒光信號強度可反映實驗體系的背景水平,若其信號過高,提示可能存在抗體濃度過高、細胞懸液雜質多、Fc受體封閉不充分等問題,需優化實驗條件。

二、選擇同型對照的關鍵匹配條件
同型對照的選擇需遵循**“完全匹配”原則**,任何一項不匹配都會導致對照失效,具體匹配條件如下:
1、免疫球蛋白亞型(最核心條件)
必須與目標抗體的宿主物種+Ig亞型完全一致,因為不同亞型的IgG(如IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3)的Fc段結構不同,與細胞Fc受體的結合能力差異顯著。
例1:目標抗體為鼠源IgG2a抗人CD4-FITC,同型對照需選鼠源IgG2a-FITC,而非鼠源IgG1-FITC。
例2:目標抗體為兔源IgG抗小鼠CD11b-APC,同型對照需選兔源IgG-APC,不能用鼠源IgG替代。
注意:雞源抗體的同型對照為IgY,而非IgG,需單獨匹配。
2、熒光素標記類型
同型對照的熒光素種類必須與目標抗體完全一致,不同熒光素的熒光強度、發射波長不同,無法相互替代。
例:目標抗體為PE標記,同型對照必須是PE標記;若目標抗體為APC-Cy7標記,同型對照也需為APC-Cy7標記。
額外注意:熒光素的偶聯效率盡量接近,若目標抗體熒光素偶聯率高,而同型對照偶聯率低,會導致對照信號偏低,誤判陽性群體。
3、抗體濃度與染色條件
同型對照的工作濃度需與目標抗體完全相同,且染色步驟(孵育溫度、時間、洗滌條件)需保持一致。
若目標抗體用1μg/10?細胞的濃度染色,同型對照也需用1μg/10?細胞;若濃度過高,會增加非特異性結合,導致對照信號失真。
4、宿主物種
需與目標抗體的宿主物種一致,避免因物種差異導致Ig結構不同,影響Fc受體結合特性。
例:鼠源抗體的同型對照不能用兔源抗體,否則無法準確反映鼠源抗體的非特異性結合水平。
5、抗體修飾與劑型
若目標抗體為交聯抗體、片段化抗體(如Fab段)等特殊劑型,同型對照也需選擇相同修飾類型的抗體,因為完整IgG與Fab段的非特異性結合特性不同。
三、特殊場景的同型對照選擇要點
1、多重染色實驗
每一種熒光標記的目標抗體都需要對應匹配的同型對照,且需注意不同同型對照之間無熒光串色干擾。
2、細胞內染色實驗
同型對照需經歷與目標抗體相同的細胞通透化處理,因為通透劑可能改變抗體與細胞內成分的非特異性結合特性。
3、無同型對照匹配時的替代方案
若無法找到完全匹配的同型對照,可選用未染色細胞作為陰性對照,或選用針對無關抗原的同亞型抗體(如檢測人細胞時用鼠IgG1抗雞卵清蛋白抗體),但效果弱于標準同型對照。






