重組蛋白的純化工藝中，親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析的組合策略是什么？

日期：2025-12-19 14:00:44

重組蛋白純化工藝中，親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析的組合核心遵循“先富集、再精純、后拋光”的原則，順序需結(jié)合蛋白理化性質(zhì)靈活調(diào)整；而最優(yōu)純化方案的選擇，關(guān)鍵是匹配蛋白的親和標(biāo)簽、等電點(diǎn)、分子量、穩(wěn)定性等核心特征。

一、三種層析技術(shù)的經(jīng)典組合策略

1.標(biāo)準(zhǔn)組合順序：親和層析→離子交換層析→凝膠過濾層析

這是最通用的純化流程，適配絕大多數(shù)帶親和標(biāo)簽的重組蛋白。

第一步：親和層析——粗純富集，減負(fù)后續(xù)步驟

這一步是純化的核心前置步驟，利用靶蛋白的親和標(biāo)簽（如His、GST、Flag）與層析介質(zhì)配體的特異性結(jié)合，直接處理細(xì)胞裂解液。靶蛋白會被特異性吸附在層析柱上，雜蛋白、核酸、色素等雜質(zhì)隨流穿液流出；再用洗脫液（如咪唑洗脫His標(biāo)簽蛋白）將靶蛋白洗脫，可將蛋白純度從1%~5%快速提升至50%~80%，大幅減少后續(xù)層析的處理負(fù)荷。

該步驟的優(yōu)勢是特異性極強(qiáng)，一步就能實(shí)現(xiàn)高效富集，尤其適合初始樣品中靶蛋白含量低的場景。

第二步：離子交換層析——精細(xì)除雜，提升純度

以親和層析的洗脫液作為上樣液，利用蛋白表面電荷差異進(jìn)行分離。根據(jù)靶蛋白的等電點(diǎn)，選擇陰離子或陽離子交換介質(zhì)：當(dāng)緩沖液pH高于蛋白等電點(diǎn)時(shí)，蛋白帶負(fù)電，結(jié)合陰離子交換介質(zhì)；當(dāng)緩沖液pH低于蛋白等電點(diǎn)時(shí)，蛋白帶正電，結(jié)合陽離子交換介質(zhì)。

上樣后用梯度離子強(qiáng)度緩沖液（如逐步提高NaCl濃度）洗脫，雜蛋白因與介質(zhì)的結(jié)合力不同被先后洗脫，靶蛋白被精準(zhǔn)分離。這一步可將蛋白純度提升至90%~95%，有效去除親和層析殘留的宿主細(xì)胞蛋白、同源雜蛋白等。

第三步：凝膠過濾層析——拋光均一，保障活性

這是純化的終末“拋光”步驟，利用分子篩效應(yīng)，按蛋白分子量大小分離。層析柱內(nèi)的多孔凝膠顆粒會讓小分子雜質(zhì)（如鹽離子、肽段）進(jìn)入孔道，流經(jīng)路徑長、洗脫速度慢；靶蛋白因分子量較大無法進(jìn)入孔道，隨流動相快速流出；而蛋白聚集體、降解片段則因分子量更大，會最先被洗脫。

該步驟不僅能將蛋白純度最終提升至95%~99%，還能去除聚集體和降解產(chǎn)物，同時(shí)實(shí)現(xiàn)緩沖液置換（將洗脫液換成實(shí)驗(yàn)所需的緩沖體系，如PBS），保證蛋白的均一性和活性。