單克隆抗體制備中,雜交瘤細胞株的篩選策略是什么?如何保證篩選出的陽性克隆具有穩定的抗體分泌能力?
日期:2025-12-19 13:40:57
單克隆抗體制備中,雜交瘤細胞株的篩選核心是分兩步篩除無關細胞(未融合的脾細胞、骨髓瘤細胞),并驗證目標抗體的特異性與分泌穩定性,整體策略分為初篩和復篩兩個階段,同時結合亞克隆和穩定性傳代驗證來保障陽性克隆的抗體分泌能力。
一、雜交瘤細胞株的篩選策略(初篩+復篩)
二、保證陽性克隆具有穩定抗體分泌能力的關鍵措施
一、雜交瘤細胞株的篩選策略(初篩+復篩)
雜交瘤細胞融合后,體系中會存在3類細胞:未融合的脾細胞(會自行凋亡)、未融合的骨髓瘤細胞、融合成功的雜交瘤細胞。篩選的核心是先淘汰骨髓瘤細胞,再篩選出能分泌目標抗體的雜交瘤細胞。
1.第一步:選擇性培養基篩選(淘汰骨髓瘤細胞,初篩的基礎)
融合后的細胞懸液會被接種到HAT選擇性培養基中培養,原理是利用嘌呤和嘧啶的合成通路差異實現篩選:
正常細胞(脾細胞、雜交瘤細胞)可通過補救途徑利用培養基中的次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)合成核酸,維持生長。
用于融合的骨髓瘤細胞是HGPRT?(次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺陷型)或TK?(胸苷激酶缺陷型)細胞,無法利用補救途徑合成核酸;同時HAT培養基中的氨基蝶呤(A)會阻斷核酸合成的從頭途徑。
最終結果:未融合的骨髓瘤細胞因無法合成核酸而死亡;未融合的脾細胞在體外培養條件下只能存活1~2周;只有融合成功的雜交瘤細胞能在HAT培養基中持續生長。
2.第二步:抗體特異性初篩(篩選分泌目標抗體的雜交瘤)
當雜交瘤細胞在HAT培養基中形成肉眼可見的單克隆集落后,收集細胞培養上清液,采用與目標抗體應用場景匹配的檢測方法進行初篩,核心是驗證上清液中是否存在能與靶抗原結合的抗體。
常用初篩方法及適用場景:
ELISA:最常用的初篩方法,操作簡單、通量高,適合檢測可溶性抗原或包被抗原的抗體,能快速篩選出陽性克隆。
間接免疫熒光(IFA):適合檢測細胞表面抗原或細胞內抗原的抗體,可直觀判斷抗體的結合特異性和定位。
Western Blot(WB):適合檢測針對變性抗原表位的抗體,能驗證抗體與靶蛋白的特異性結合,避免針對構象表位的假陽性。
流式細胞術(FCM):適合檢測細胞膜表面抗原的抗體,靈敏度高,適合微量抗體的檢測。
3.第三步:抗體性能復篩(篩選高特異性、高親和力的陽性克隆)
初篩得到的陽性克隆可能存在抗體親和力低、交叉反應強的問題,需要進一步復篩,剔除假陽性和低性能克隆,復篩的核心是嚴格驗證抗體的特異性和親和力:
特異性驗證:用與靶抗原有同源性的蛋白或無關抗原進行交叉反應測試,只有不與無關抗原結合的克隆才保留。
親和力驗證:通過ELISA法測定抗體的效價(稀釋倍數),效價越高代表抗體親和力越強;也可通過競爭結合實驗判斷抗體與抗原的結合強度。
匹配應用場景驗證:如果抗體用于免疫組化(IHC),需用組織切片驗證抗體的染色效果;用于免疫沉淀(IP),需驗證抗體的沉淀效率,確保篩選出的克隆符合實際應用需求。

二、保證陽性克隆具有穩定抗體分泌能力的關鍵措施
雜交瘤細胞在傳代過程中可能發生染色體丟失,導致抗體分泌能力下降甚至喪失,因此需要通過以下步驟保障穩定性:
1.及時進行亞克隆化培養(核心措施)
初篩和復篩得到的陽性克隆,大概率是多個雜交瘤細胞形成的混合集落,需要通過有限稀釋法或軟瓊脂克隆法進行亞克隆,目的是獲得單克隆細胞株:
有限稀釋法:將陽性克隆細胞懸液梯度稀釋,接種到96孔板中,使每孔只含有1個細胞,培養后形成單克隆集落,再次檢測上清液的抗體分泌情況,保留陽性單克隆。
該步驟需重復2~3次,確保最終得到的克隆是真正的單克隆,避免因多克隆混合導致的后續分泌不穩定。
2.進行長期傳代穩定性驗證
將亞克隆得到的單克隆細胞株連續傳代10~20代,每代都檢測細胞培養上清液的抗體效價:
如果傳代過程中抗體效價保持穩定,說明該克隆的染色體穩定,抗體分泌能力可靠。
如果效價逐漸下降,說明細胞發生了染色體丟失,需淘汰該克隆,重新選擇亞克隆中的其他陽性株。
3.優化細胞培養條件,避免細胞應激
采用無血清培養基或低血清培養基培養,減少血清中雜蛋白的干擾,同時維持細胞的穩定生長狀態。
控制細胞傳代密度,避免細胞過度密集或過度稀疏,防止細胞因營養不足或接觸抑制導致狀態變差。
培養過程中避免頻繁更換培養基或調整培養條件,減少細胞應激反應。
4.及時凍存陽性克隆,備份細胞株
篩選得到穩定分泌抗體的單克隆細胞株后,需及時凍存:
凍存時采用凍存液(培養基+10%DMSO+20%胎牛血清),程序降溫后放入液氮中保存。
凍存的細胞可作為種子庫,后續需要時復蘇,避免長期傳代導致的抗體分泌能力衰退;復蘇后需再次驗證抗體分泌能力,確保穩定性。






