標簽內參抗體的效價通常通過什么實驗方法進行評估?
日期:2025-12-11 09:37:14
標簽內參抗體的效價評估,核心是通過定量或半定量實驗檢測抗體與目標標簽(如His、GST、Myc、Flag、HA等)的特異性結合能力,最終反映抗體在實際應用場景中的有效稀釋范圍(效價本質是抗體活性的量化指標,而非單純濃度)。常用實驗方法按“特異性優先、實用性匹配”原則排序,具體如下:
一、核心方法:ELISA(酶聯免疫吸附試驗)——效價評估的“金標準”
ELISA是評估抗體效價最常用、最精準的方法,能直接量化抗體的結合活性和有效稀釋倍數,尤其適合篩選最佳工作濃度。
實驗原理:將純化的標簽融合蛋白抗原(如His-重組蛋白、GST-載體蛋白)包被在酶標板上,加入梯度稀釋的待評估標簽抗體(一抗),再通過酶標二抗(抗一抗種屬的IgG偶聯HRP/AP)結合,最后通過底物顯色(如TMB顯色),用酶標儀檢測吸光度(OD值)。
效價判定標準:以“OD值≥2.1×空白對照OD值(Cut-off值)”為陽性閾值,對應的最高抗體稀釋倍數即為該抗體的效價。例如:抗體稀釋至1:10000時仍滿足Cut-off標準,而1:20000時OD值低于閾值,則效價為1:10000。
優勢:特異性強(僅檢測抗體與標簽的結合)、定量準確、可重復性高,能直接指導后續實驗的抗體稀釋比例;
注意事項:包被抗原需高純度(≥95%),避免雜蛋白干擾;稀釋梯度需合理(通常從1:100、1:500、1:1000……到1:100000),覆蓋可能的有效范圍。

二、實用方法:Western Blot(蛋白質印跡)——貼合實際應用的效價驗證
WB是標簽抗體最常用的應用場景,因此通過WB評估效價,能直接反映抗體在實際實驗中的表現,更具參考價值。
實驗原理:將含目標標簽的蛋白樣品(如重組標簽蛋白、轉染后表達標簽蛋白的細胞裂解液)進行SDS-PAGE電泳,轉印至PVDF/NC膜后,用梯度稀釋的標簽抗體孵育,再通過二抗(偶聯HRP)和化學發光底物(ECL)顯影,觀察條帶強度。
效價判定標準:以“能檢測到清晰、特異性條帶(無明顯雜帶)”為標準,對應的最高抗體稀釋倍數即為WB實驗中的有效效價。例如:抗體稀釋1:5000時條帶清晰,1:10000時條帶微弱或消失,則WB場景下效價為1:5000。
優勢:模擬實際應用場景,同時能驗證抗體特異性(是否有雜帶),結果直觀;
注意事項:樣品中需含足量標簽蛋白(避免因抗原量不足誤判效價);封閉條件、孵育時間需標準化(如室溫孵育1小時或4℃過夜),確保結果可重復。
三、補充方法:Dot Blot(斑點印跡)——快速初篩效價
Dot Blot是一種快速、簡便的效價初篩方法,無需電泳和轉印步驟,適合批量抗體的初步評估或快速篩選。
實驗原理:將純化的標簽抗原直接點樣在PVDF/NC膜上,干燥后封閉,加入梯度稀釋的標簽抗體,后續通過二抗顯色(ECL或DAB),觀察斑點的顯色強度。
效價判定標準:以“能觀察到明顯顯色斑點”為陽性,對應的最高抗體稀釋倍數為初篩效價。
優勢:操作快速(1-2小時完成)、樣本用量少(抗原僅需幾微升)、成本低;
局限性:定量精度低于ELISA,無法觀察抗原分子量(難以排除雜帶干擾),僅適合初篩,需結合ELISA或WB進一步確認。
四、特殊場景方法:免疫熒光(IF/ICC/IHC)——細胞/組織水平的效價評估
若標簽抗體用于細胞免疫熒光(IF)、免疫細胞化學(ICC)或免疫組織化學(IHC),需針對性評估其在細胞/組織樣本中的效價,模擬實際應用場景。
實驗原理:將表達標簽蛋白的細胞(或組織切片)固定后,加入梯度稀釋的標簽抗體,再通過熒光二抗(偶聯FITC、Cy3等)結合,用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察熒光強度和特異性(是否有非特異性染色)。
效價判定標準:以“熒光信號強、背景低、無明顯非特異性染色”為標準,對應的最高抗體稀釋倍數為該場景下的效價。
優勢:貼合細胞/組織水平的應用需求,直接驗證抗體在天然環境中的結合活性;
注意事項:需確保細胞/組織中標簽蛋白正確表達(可通過陽性對照驗證);固定和通透條件需優化(避免破壞標簽抗原的抗原性)。
五、效價評估的關鍵注意事項
特異性優先:效價評估需同時驗證抗體特異性(如ELISA中空白對照、陰性抗原對照需無顯色;WB中無雜帶),僅“高稀釋倍數有信號但雜帶多”的抗體,不能視為高效價;
抗原匹配:評估用的抗原需與抗體目標標簽完全匹配(如His抗體需用His標簽抗原,而非GST標簽抗原),避免因抗原不匹配導致誤判;
稀釋梯度設計:抗體稀釋需采用對數梯度(如1:100、1:500、1:1000、1:5000、1:10000……),確保能準確找到“有效稀釋上限”;
對照設置:必須設置空白對照(無抗體)、陰性對照(無標簽的抗原/細胞)、陽性對照(已知效價的同類型標簽抗體),排除非特異性信號干擾。
標簽內參抗體的效價評估以ELISA(定量精準)為核心,WB(貼合應用)為主要驗證方法,DotBlot用于快速初篩,IF/ICC/IHC針對細胞/組織場景專項評估。實際應用中,需根據抗體的最終使用場景選擇對應的評估方法,確保效價結果能直接指導實驗中的抗體稀釋比例(如ELISA效價1:10000,實際實驗可選用1:5000-1:8000以保證信號強度和特異性)。






