抗體定制過程中,抗原的純度和濃度需達到什么標準才能啟動實驗?
日期:2025-12-11 09:32:23
在抗體定制實驗啟動前,抗原的純度和濃度需滿足明確的核心標準,且不同抗體類型(多克隆、單克隆、重組抗體)和抗原類型(蛋白抗原、小分子半抗原)的要求略有差異,具體如下:
一、純度要求(決定抗體特異性的核心指標)
抗原純度直接影響抗體的特異性,雜蛋白或雜質會誘導非特異性抗體,增加后續純化難度、降低抗體效價,甚至導致實驗失敗,不同場景的純度底線和理想狀態如下:
多克隆抗體制備(免疫兔、羊、小鼠等動物):最低純度需≥90%,通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色可觀察到單一主條帶,雜帶占比不超過10%;理想純度≥95%,無明顯雜帶,能最大程度減少非特異性抗體的產生,后續親和純化可快速獲得高特異性抗體。若純度低于85%,需先通過親和層析、凝膠過濾或離子交換層析進一步純化,不可直接啟動免疫。
單克隆抗體制備(細胞融合):對純度要求更高,最低純度≥95%,理想純度≥98%。高純度抗原能避免雜蛋白誘導“雜克隆”,顯著提高陽性雜交瘤的篩選效率,減少假陽性克隆;若抗原中含有血清蛋白(如BSA),需在后續篩選環節特別注意排除抗載體抗體的干擾。
重組抗體(噬菌體展示、酵母展示等技術):最低純度≥95%,理想純度≥98%。重組抗體篩選依賴抗原與抗體片段的特異性結合,雜蛋白會直接干擾篩選效率,同時還需確保抗原折疊正確(即“活性純度”),避免因構象錯誤導致無法誘導功能性抗體。
小分子抗原(半抗原):化學純度最低需≥95%,通過HPLC驗證無明顯雜質;理想純度≥98%。小分子需與載體蛋白(如BSA、KLH)偶聯后才能具備免疫原性,自身純度直接影響偶聯效率和免疫原的抗原密度,純度不足會導致偶聯產物活性低下。
純度驗證需結合抗原類型選擇方法:蛋白抗原常用SDS-PAGE(還原/非還原型)+染色定量雜帶占比,高精度需求可采用銀染或HPLC(SEC/HIC法);小分子/化學合成抗原需通過HPLC(反相/正相)+質譜(MS)驗證純度和分子量正確性;重組抗原還需額外驗證活性(如酶活、受體結合活性),避免“純而無活性”的情況。

二、濃度要求(滿足免疫/篩選的劑量需求)
抗原濃度需足夠支撐實驗全流程(包括動物免疫、雜交瘤篩選、重組抗體篩選等),濃度過低會導致免疫原性不足、篩選信號微弱,影響實驗效果,具體標準如下:
1、蛋白抗原(按抗體類型劃分):
多克隆抗體(兔/羊免疫):最低啟動濃度≥1mg/mL,理想濃度2-5mg/mL。單次免疫兔的劑量通常為50-100μg/只,需準備3-5次加強免疫,總需求量約1-3mg,濃度≥1mg/mL可避免免疫體積過大(單次免疫體積一般≤0.5mL),確保每次免疫的有效劑量;羊免疫的劑量和濃度要求與兔相近。
多克隆抗體(小鼠免疫):最低啟動濃度≥0.5mg/mL,理想濃度1-3mg/mL。小鼠單次免疫劑量僅10-20μg/只,總需求量約0.5-1mg,但濃度過低會導致免疫原劑量不足,最終抗體效價難以提升。
單克隆抗體(細胞融合):最低啟動濃度≥1mg/mL,理想濃度≥2mg/mL。除滿足動物免疫需求外,抗原還需用于雜交瘤篩選(如ELISA包被,常用濃度1-5μg/mL),總需求量約1-2mg,高濃度可減少抗原損耗,保證篩選環節的重復性。
重組抗體篩選(噬菌體展示等):最低啟動濃度≥0.1mg/mL,理想濃度0.5-1mg/mL。篩選環節需將抗原用于固相包被(濃度0.1-1μg/mL)或液相篩選,總需求量較小(約50-200μg),但濃度需穩定以保證篩選結果的可靠性。
2、小分子抗原(半抗原):
偶聯前濃度:≥5mg/mL,需溶于DMSO或適配的水相緩沖液。偶聯效率通常為10-20個半抗原/載體蛋白分子,足夠濃度才能保證偶聯后免疫原的抗原密度,滿足免疫需求。
偶聯后免疫原濃度:≥1mg/mL(載體蛋白與半抗原的偶聯物濃度),需達到動物免疫的劑量標準,避免因濃度不足導致免疫失敗。
濃度驗證需根據抗原類型選擇合適方法:蛋白抗原常用BCA法、Bradford法(需避開還原劑、去污劑等干擾物質),若抗原純度已知,也可通過UV吸光度(A280)結合消光系數計算濃度;小分子抗原可通過HPLC定量或根據其特征吸收峰的UV吸光度法測定。
三、實驗啟動的核心前提(最低門檻)
啟動抗體定制實驗前,抗原需同時滿足以下條件:
純度達標:蛋白抗原用于多抗制備≥90%、單抗/重組抗制備≥95%,小分子抗原≥95%;
濃度達標:蛋白抗原用于小鼠免疫≥0.5mg/mL、兔/羊免疫/單抗制備≥1mg/mL,小分子偶聯前≥5mg/mL;
活性達標:蛋白抗原需具備天然構象(如重組受體蛋白可結合配體、酶類具有催化活性),避免變性抗原影響抗體誘導效果。
若抗原純度、濃度未達標,不建議直接啟動實驗,需先通過純化(蛋白抗原用層析法、小分子抗原用重結晶或制備型HPLC)、濃縮(蛋白抗原用超濾管,小分子抗原用減壓濃縮)等方式優化;若重組抗原“純而無活性”,需優化表達體系或復性緩沖液,確保抗原正確折疊。強行使用不達標抗原會導致抗體效價低、特異性差、純化難度增加,最終延長實驗周期、增加成本,甚至需重新制備抗原。






