Western Blot實驗時,標簽內參抗體的稀釋比例通常怎么確定?
日期:2025-12-10 13:22:05
Western Blot實驗中標簽內參抗體的稀釋比例沒有絕對統一標準,主要依據抗體說明書、實驗體系及樣本特性綜合確定,具體方法和原則如下:
3、通過預實驗優化最佳比例
4、考慮實驗體系的其他影響因素
1、優先遵循抗體說明書的推薦范圍
正規抗體廠家會在說明書中標注該標簽內參抗體的WB推薦稀釋比例(常見范圍為1:1000–1:5000,部分高親和力抗體可至1:10000),這是最基礎且最具參考性的初始比例,比如His標簽抗體常推薦1:2000,Flag標簽抗體多為1:3000。
2、結合實驗樣本的靶標豐度調整
2、結合實驗樣本的靶標豐度調整
若樣本中標簽融合蛋白表達豐度高(如過表達細胞系),可適當提高稀釋比例(如從1:2000調至1:5000),避免條帶過曝、出現拖尾;
若靶標豐度低(如內源性表達樣本),則需降低稀釋比例(如從1:3000降至1:1000),提升抗體結合效率以增強信號。

3、通過預實驗優化最佳比例
對于無明確推薦或需精準結果的實驗,可設置梯度稀釋預實驗(如1:500、1:1000、1:2000、1:5000),同時保持一抗孵育時間、二抗比例等其他條件一致,根據條帶的清晰度、背景深淺及信噪比,篩選出最優稀釋比例。
4、考慮實驗體系的其他影響因素
封閉液類型:使用脫脂奶粉封閉時,若存在蛋白結合干擾,可適當降低抗體稀釋比例;
二抗親和力:高靈敏度二抗(如熒光標記二抗)可搭配更高比例的一抗稀釋液;
曝光條件:化學發光檢測的曝光時間可與抗體稀釋比例聯動調整,減少非特異性背景。






