ELISA試劑盒中的洗滌緩沖液的主要成分是什么？
日期：2025-08-28 14:57:31
在ELISA實驗中，洗滌緩沖液（Wash Buffer）的核心功能是去除未結(jié)合的游離試劑（如未結(jié)合的抗體、酶標(biāo)記物、封閉液殘留等），減少非特異性吸附帶來的背景干擾，同時維持反應(yīng)體系的 pH 穩(wěn)定，保障后續(xù)實驗步驟的特異性。其成分設(shè)計需平衡 “洗滌效率” 與 “對固相結(jié)合物的保護(hù)”，核心成分可分為4類，具體如下：
一、洗滌緩沖液的核心成分及作用
ELISA洗滌緩沖液多以 “緩沖鹽溶液為基礎(chǔ)，添加表面活性劑增強(qiáng)洗滌效果，部分含防腐劑延長保質(zhì)期”，各類成分的功能及常用規(guī)格如下：
| 成分類別 | 常用物質(zhì) | 核心作用 | 典型濃度 / 規(guī)格 |
| 1. 緩沖鹽（基礎(chǔ)骨架） | 磷酸二氫鈉（NaH?PO?）、磷酸氫二鈉（Na?HPO?） | 維持洗滌液的 pH 穩(wěn)定（通常 pH 7.2-7.4，接近生理環(huán)境），避免 pH 波動破壞抗原 - 抗體的特異性結(jié)合，同時保護(hù)酶（如 HRP）的活性。 | 組成PBS（磷酸鹽緩沖液）：0.01 mol/L（即 10 mM），其中 NaH?PO?與 Na?HPO?按比例混合（如 pH 7.4 時，二者濃度約為 1.8 mM 和 8.2 mM）。 |
| Tris（三羥甲基氨基甲烷）、鹽酸（HCl） | 組成Tris-HCl 緩沖液，pH 緩沖范圍更廣（7.0-9.0），部分情況下（如 AP 酶標(biāo)記體系）比 PBS 更適合維持酶活性。 | 0.05 mol/L Tris-HCl（即 50 mM），用 HCl 調(diào)節(jié) pH 至 7.4-8.0。 | |
| 2. 表面活性劑（關(guān)鍵洗滌成分） | Tween-20（聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯） | 降低液體表面張力，增強(qiáng)洗滌液對酶標(biāo)板孔壁的浸潤性，有效剝離孔壁上 “非特異性吸附的抗體 / 酶標(biāo)記物”，同時不破壞已結(jié)合的 “抗原 - 抗體復(fù)合物”，是ELISA洗滌液中最常用的表面活性劑。 | 終濃度通常為0.05%（V/V）（即 1000 mL 緩沖鹽中加入0.5mL Tween-20），濃度過高可能導(dǎo)致特異性結(jié)合物脫落，過低則洗滌不充分。 |
| Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚） | 去污能力強(qiáng)于Tween-20，但對蛋白質(zhì)（如抗體、酶）的變性風(fēng)險略高，僅在 “非特異性吸附嚴(yán)重” 的特殊場景（如檢測疏水性抗原）中偶爾使用。 | 終濃度通常為0.01%-0.1%（V/V），需謹(jǐn)慎控制濃度。 | |
| 3. 防腐劑（延長保質(zhì)期） | 疊氮鈉（NaN?） | 抑制細(xì)菌、真菌生長，延長洗滌液（尤其是配好的工作液）的儲存時間，常用于商品化試劑盒的濃縮洗滌液中。 | 終濃度0.02%（W/V）（即0.2g/L），需注意：疊氮鈉對 HRP（辣根過氧化物酶）有輕微抑制作用，若體系為 HRP 標(biāo)記，需確保洗滌充分，避免殘留。 |
| 硫柳汞（Thiomersal） | 廣譜防腐劑，對酶活性影響更小，適合對疊氮鈉敏感的檢測體系（如部分 AP 酶標(biāo)記體系）。 | 終濃度 0.01%（W/V），但因潛在毒性，目前使用頻率低于疊氮鈉。 | |
| 慶大霉素（Gentamicin） | 抗生素類防腐劑，無毒性，對酶和抗體無影響，適合要求較高的 “無毒性實驗體系”（如細(xì)胞相關(guān) ELISA）。 | 終濃度50-100μg/mL，成本較高，多在定制化試劑盒中使用。 | |
| 4. 鹽類（調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度） | 氯化鈉（NaCl） | 維持洗滌液的離子強(qiáng)度（通常 0.137mol/L，即生理鹽水水平），減少 “因離子強(qiáng)度過低導(dǎo)致的非特異性結(jié)合”，同時避免高鹽對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。 | 與PBS或Tris-HCl配套使用，如PBS中NaCl濃度通常為137mM。 |
二、常見洗滌緩沖液配方示例
ELISA中最常用的洗滌緩沖液為 “含 Tween-20 的 PBS”（即 PBST），其經(jīng)典配方（1× 工作液）如下：
磷酸二氫鈉（NaH?PO??2H?O）：0.27g
磷酸氫二鈉（Na?HPO??12H?O）：2.9g
氯化鈉（NaCl）：8.0g
Tween-20：0.5 mL
超純水：加至 1000 mL
調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，可根據(jù)需求添加0.02% 疊氮鈉作為防腐劑。
三、使用注意事項
濃縮液需稀釋：商品化試劑盒中的洗滌液多為 10× 或 20× 濃縮液，使用前需用超純水或去離子水精確稀釋至 1× 工作液，稀釋不足會導(dǎo)致離子強(qiáng)度過高（可能破壞抗原 - 抗體結(jié)合），稀釋過度則洗滌效果下降；
室溫平衡：從冰箱取出的洗滌液需平衡至室溫（20-25℃）后使用，避免低溫導(dǎo)致酶標(biāo)板孔壁產(chǎn)生冷凝水，影響洗滌均勻性；
洗滌方式與次數(shù)：常規(guī) ELISA 需洗滌 3-5 次，每次加入洗滌液后需靜置30-60秒（即 “浸泡洗滌”），最后一次洗滌后需將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上拍干（避免殘留洗滌液影響顯色）；若為自動洗板機(jī)，需設(shè)置合適的 “加液量”（如每孔300μL）和 “抽吸次數(shù)”，確保孔內(nèi)無殘留液體；
避免反復(fù)凍融：濃縮洗滌液建議分裝后儲存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致防腐劑失效或成分沉淀；配好的 1× 工作液（含防腐劑）可在 4℃儲存 1-2 周，無防腐劑則需現(xiàn)配現(xiàn)用。
ELISA洗滌緩沖液的成分設(shè)計圍繞 “高效去游離、穩(wěn)定反應(yīng)環(huán)境、延長保質(zhì)期” 展開，其中PBST（含0.05%Tween-20的0.01M PBS） 是最通用的選擇，具體使用需嚴(yán)格參照試劑盒說明書（部分特殊檢測體系可能需要定制化洗滌液，如不含Tween-20的緩沖液）。
