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構(gòu)建基因敲除的細(xì)胞系有哪些方法和步驟?

日期:2024-07-16 13:53:17

    基因敲除常用于研究基因在細(xì)胞功能中的作用。下面是常用的基因敲除細(xì)胞系構(gòu)建方法和步驟:
 
    插入突變(Knock-in):通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源DNA片段插入至目標(biāo)基因位點(diǎn),使目標(biāo)基因發(fā)生突變而實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的。這個(gè)過程通常需要克隆目標(biāo)基因的編碼序列,并將突變(例如終止密碼子)或熒光標(biāo)記等片段插入其中。
 
    CRISPR/Cas9敲除:利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),設(shè)計(jì)合成質(zhì)粒(sgRNA和Cas9蛋白),導(dǎo)入靶向基因組并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂。通過細(xì)胞自我修復(fù)機(jī)制(非同源末端連接或同源重組),實(shí)現(xiàn)對(duì)靶向基因的敲除。
 
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    RNA干擾(RNAi):通過轉(zhuǎn)染siRNA或shRNA質(zhì)粒,引入RNAi技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的敲除。
 
    背景細(xì)胞的選擇:基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建需要使用背景細(xì)胞,如CHO、HEK293等,根據(jù)需要選擇合適的背景細(xì)胞株。
 
    細(xì)胞的篩選鑒定:針對(duì)基因敲除細(xì)胞系的構(gòu)建,需要通過PCR、Western blot或免疫組化等方法,對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行篩選鑒定,確保目標(biāo)基因的敲除效果。
 
    單克隆的建立:通過稀釋法或限稀釋法等方法,建立單克隆基因敲除細(xì)胞系,以保證其遺傳純度和穩(wěn)定性。

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