大腸桿菌表達中出現包涵體怎么辦？怎么復性？
日期：2025-06-16 13:45:35
在大腸桿菌蛋白表達過程中，包涵體的形成是常見問題，主要由蛋白質折疊異常、表達量過高或環境壓力導致。以下從減少包涵體形成和包涵體復性兩方面提供系統性解決方案：
一、減少包涵體形成的策略
（1）優化表達條件
降低誘導溫度：低溫（16-25℃）可減緩蛋白質合成速度，為折疊提供更多時間，例如在 IPTG 誘導時將溫度降至 20℃，可顯著降低包涵體比例。
控制誘導劑濃度：降低 IPTG 濃度（如 0.1-0.5 mM）或采用乳糖等溫和誘導劑，避免蛋白質爆發式表達。
延長誘導時間：采用對數生長期后期誘導，延長培養時間（12-16 小時），減少細胞代謝壓力。
優化培養基成分：添加滲透壓保護劑（如蔗糖、山梨醇）或氨基酸（如甘氨酸），改善細胞內環境。
（2）載體設計與融合標簽
融合可溶性標簽：
GST 標簽：谷胱甘肽轉移酶，通過與谷胱甘肽親和層析輔助純化，同時提高可溶性。
Trx 標簽：硫氧還蛋白，促進二硫鍵形成，常用于含半胱氨酸的蛋白。
MBP 標簽：麥芽糖結合蛋白，通過分子伴侶作用增強折疊，適用于小分子量蛋白。
添加分子伴侶或折疊酶：共表達伴侶蛋白（如 GroEL/GroES、DnaK/DnaJ）或折疊酶（如 PDI），輔助蛋白質正確折疊。
（3）宿主菌株選擇
選用蛋白折疊能力強的菌株：
Rosetta 系列：補充稀有 tRNA，減少翻譯錯誤導致的聚集。
Origami 系列：硫氧還蛋白還原酶（trxB）和谷胱甘肽還原酶（gor）缺陷，促進胞內二硫鍵形成，適用于分泌型蛋白。
Bl21(DE3)pLysS：低背景表達，適合毒性蛋白表達。
（4）分泌表達策略
融合信號肽：如 pelB、ompA 信號肽，引導蛋白分泌至周質空間，利用周質空間的氧化環境促進折疊，減少胞質內聚集。
優化信號肽切割位點：避免信號肽未正確切割導致的蛋白不穩定。
二、包涵體復性的完整流程
（1）包涵體的提取與溶解
收集與破碎細胞：
離心收集菌體（5000-8000×g，10 分鐘），用 PBS 洗滌去除培養基雜質。
超聲破碎或高壓均質破碎細胞，破碎液 4℃離心（12000×g，20 分鐘），沉淀即為包涵體。
洗滌包涵體：
用含 0.5% Triton X-100 和 1-2 M 尿素的緩沖液洗滌 2-3 次，去除吸附的雜蛋白和脂類。
溶解包涵體：
使用 8 M 尿素或 6 M 鹽酸胍（變性劑）溶解包涵體，添加 10-100 mM DTT 或 β- 巰基乙醇（還原劑）破壞錯誤的二硫鍵，4℃攪拌溶解 2-4 小時。
（2）復性方法與優化
1. 常用復性方法
稀釋復性法：
操作：將溶解的蛋白溶液緩慢加入 10-100 倍體積的復性緩沖液（含 0.1-0.5 M 精氨酸、1-5 mM 氧化還原對 GSH/GSSG，pH 7.0-9.0），室溫或 4℃靜置 12-24 小時。
優點：操作簡單，成本低；缺點：體積大，適用于小量蛋白。
透析復性法：
操作：將蛋白溶液裝入透析袋，依次通過含 8 M 尿素→6 M→4 M→2 M→0 M 尿素的復性緩沖液（逐步降低變性劑濃度），每次透析 4-6 小時，添加氧化還原對和滲透壓調節劑（如 PEG）。
優點：變性劑濃度梯度可控，蛋白濃度較高；缺點：耗時較長，需注意避免透析袋污染。
層析復性法：
原理：利用親和層析（如 Ni-NTA）或離子交換層析，在層析柱上實現變性劑梯度洗脫與蛋白復性同步進行。
優點：復性效率高（可達 50-80%），可同時純化；缺點：需特定層析柱，成本較高。
2. 復性緩沖液優化
氧化還原體系：使用 1-5 mM GSH（還原型）和 0.1-1 mM GSSG（氧化型），比例通常為 10:1，促進二硫鍵正確形成。
添加劑：
精氨酸（0.1-0.5 M）：抑制蛋白聚集，通過破壞疏水相互作用穩定中間態。
PEG（5-10%）：模擬分子擁擠環境，促進折疊；甘氨酸（1-2 M）：降低溶液極性，穩定蛋白結構。
去污劑（如 Triton X-100，0.01-0.1%）：抑制疏水表面聚集，適用于膜蛋白復性。
pH 與溫度：多數蛋白在 pH 7.5-9.0 復性，堿性環境減少巰基氧化；溫度控制在 4-25℃，避免高溫導致聚集。
3. 復性效率提升策略
降低蛋白濃度：復性時蛋白濃度控制在 0.1-1 mg/mL，避免高濃度導致的分子間聚集。
分步復性：先快速降低變性劑濃度至中等水平（如 2 M 尿素），形成部分折疊中間體，再緩慢降至 0 M，減少錯誤折疊。
添加分子伴侶模擬物：如 GroEL 抗體或人工合成的分子伴侶，輔助中間體折疊。
三、復性效果驗證與問題排查
SDS-PAGE 檢測：對比復性前后蛋白條帶，觀察可溶性蛋白比例及聚集情況。
活性測定：通過酶活性、結合活性等功能實驗驗證復性蛋白的生物學活性。
常見問題與解決方案：
復性效率低：嘗試更換復性方法（如稀釋法→層析法），或優化氧化還原對比例。
聚集重新形成：增加精氨酸濃度或添加 PEG，降低復性溫度至 4℃。
二硫鍵錯誤：調整 GSH/GSSG 比例（如從 10:1 改為 5:1），或添加 Cu²+ 促進氧化。
四、案例參考
重組人胰島素復性：采用稀釋法，在 pH 8.0 緩沖液中加入 1 mM GSH/0.1 mM GSSG 和 0.3 M 精氨酸，復性效率可達 60% 以上。
綠色熒光蛋白（GFP）復性：通過 Ni-NTA 層析復性，在洗脫液中逐步降低尿素濃度（8 M→0 M），同時添加 5% PEG，活性恢復率超 70%。
通過系統優化表達條件與復性策略，可顯著提高重組蛋白的可溶性表達與活性回收率。若問題持續，建議結合蛋白結構特性（如是否含二硫鍵、跨膜區）調整方案，或嘗試真核表達系統（如酵母、昆蟲細胞）避免包涵體形成。
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