重組蛋白的標簽(如His、GST、Flag、Fc)對其結構和功能有什么影響?標簽切除的必要性和方法是什么?
日期:2025-12-23 13:57:16
重組蛋白的標簽(如His、GST、Flag、Fc)是蛋白表達與純化的核心輔助工具,它們會從溶解性、空間構象、生物活性等方面對目標蛋白產生不同程度的影響;標簽切除的必要性則取決于蛋白的最終應用場景,對應的切除方法也與標簽的設計直接相關。
一、常見標簽對重組蛋白結構和功能的影響
不同標簽的分子大小、帶電性、空間結構差異較大,對目標蛋白的影響程度也不同,具體如下:
1、His標簽(組氨酸標簽,通常6×His)
結構影響:分子極小(約0.8kDa),呈柔性,一般不會嵌入目標蛋白的空間結構內部,對蛋白構象的干擾極弱;但在少數情況下,若標簽融合位點靠近蛋白的活性中心,可能會輕微影響局部構象。
功能影響:幾乎不影響蛋白的生物活性,尤其適合膜蛋白、酶類等功能敏感型蛋白。僅在蛋白需結合帶負電的靶點時,His標簽的弱堿性可能引發微量非特異性結合,但可通過優化緩沖液條件消除。
附加優勢:耐變性(可在8M尿素、6M鹽酸胍條件下純化),適配包涵體蛋白的復性純化。
2、GST標簽(谷胱甘肽S-轉移酶標簽,約26kDa)
結構影響:分子量大,且具有穩定的球狀結構,容易與目標蛋白形成空間位阻,可能改變目標蛋白的折疊方式;對于小分子蛋白(<20kDa),GST的空間占比過高,甚至可能導致蛋白錯誤折疊。
功能影響:一方面,GST能顯著提升難溶性蛋白的可溶性表達(這是其核心優勢);另一方面,其較大的分子體積可能遮蔽目標蛋白的活性位點,抑制蛋白與配體、受體的結合能力,尤其對抗體、細胞因子等功能依賴構象的蛋白影響較明顯。
附加特點:可通過谷胱甘肽親和層析實現高純度純化,但純化后蛋白的分子量會明顯增大。
3、Flag標簽(DYKDDDDK,8個氨基酸,約1kDa)
結構影響:分子小、親水性強,對目標蛋白構象的干擾非常小,且可靈活融合在蛋白的N端或C端,不易影響蛋白折疊。
功能影響:幾乎不影響蛋白生物活性,適合用于蛋白-蛋白相互作用研究、免疫熒光檢測等場景;其特異性極高的識別序列(抗Flag抗體僅識別該8肽),可避免非特異性結合對功能實驗的干擾。
附加優勢:洗脫條件溫和(可通過游離Flag肽競爭洗脫),能最大程度保持蛋白活性。
4、Fc標簽(免疫球蛋白Fc段,約25kDa)
結構影響:分子量較大,且具有天然的二聚化特性,可能誘導目標蛋白形成二聚體;Fc段的糖基化修飾也可能影響目標蛋白的糖基化模式(若目標蛋白本身含糖基化位點)。
功能影響:優勢是能延長重組蛋白在體內的半衰期(Fc段可結合Fc受體,減少蛋白被快速清除),同時提升蛋白的可溶性;劣勢是Fc段可能引發非特異性免疫反應(用于體內實驗時),或遮蔽目標蛋白的功能區域。
適用場景:常用于治療性蛋白(如抗體融合蛋白、細胞因子)的體內應用。

二、標簽切除的必要性
標簽切除并非必須,核心取決于重組蛋白的最終用途:
1、需要切除標簽的場景
體內功能實驗/治療性應用:如動物體內給藥、細胞活體成像、臨床前藥物研發。殘留的標簽可能引發免疫原性反應(如GST、Fc),或影響蛋白在體內的代謝、靶向性。
結構生物學研究:如X射線晶體衍射、冷凍電鏡解析蛋白結構。標簽的存在可能干擾蛋白結晶,或導致晶體質量下降,無法解析真實的目標蛋白結構。
高精度功能實驗:如酶活測定、受體結合實驗。若標簽遮蔽活性位點(如GST對小分子酶的影響),必須切除以恢復蛋白天然功能。
2、無需切除標簽的場景
體外純化與定性檢測:如WesternBlot、ELISA、蛋白電泳鑒定,標簽不影響檢測結果。
親和純化的中間載體:如用His標簽純化目標蛋白后,僅需獲得粗純蛋白用于后續實驗。
標簽本身具備輔助功能:如用Fc標簽延長體內半衰期,用GST維持蛋白可溶性,此時保留標簽反而更有利。
三、標簽切除的方法
標簽切除的核心是在標簽與目標蛋白之間插入特異性蛋白酶切割位點,常見策略如下:
1、酶切法(最常用)
核心設計:在標簽和目標蛋白的連接區域,插入蛋白酶的特異性識別序列(如凝血酶識別位點、腸激酶識別位點、TEV蛋白酶識別位點)。
常見蛋白酶與特點
凝血酶:識別序列為Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser,切割位點在Arg和Gly之間;酶切條件溫和,但可能存在微量非特異性切割。
腸激酶:識別序列為Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,切割位點在Lys之后;特異性極高,且切割后不殘留多余氨基酸,適合對N端序列敏感的蛋白。
TEV蛋白酶:識別序列為Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly,特異性強,酶切效率高,且TEV蛋白酶本身可帶His標簽,便于酶切后通過親和層析去除。
操作流程:目標蛋白與標簽經親和純化后,加入對應蛋白酶,在適宜溫度、pH下孵育(通常4℃孵育過夜);酶切完成后,通過二次親和層析(去除標簽和蛋白酶)或分子篩層析,獲得純的目標蛋白。
2、自剪切標簽法(無需額外加酶)
利用具有自剪切活性的標簽(如內含肽標簽),在特定條件下(如改變溫度、pH,或加入巰基試劑),標簽可自動從目標蛋白上剪切下來。
優勢是無需額外添加蛋白酶,避免蛋白酶殘留;劣勢是自剪切效率受條件影響較大,且標簽設計較復雜。
3、化學切割法(少用)
利用化學試劑(如溴化氰)切割特定氨基酸位點(如溴化氰切割Met殘基),但該方法條件劇烈(如強酸環境),容易導致目標蛋白變性,僅適用于對化學試劑耐受的蛋白。




