長(zhǎng)期使用標(biāo)簽內(nèi)參抗體，如何判斷其活性是否下降，可通過什么實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證？
日期：2025-12-16 14:01:23
長(zhǎng)期使用的標(biāo)簽內(nèi)參抗體，活性下降會(huì)直接表現(xiàn)為信號(hào)減弱、背景升高或特異性變差，判斷其活性是否下降，可通過標(biāo)準(zhǔn)化的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)合關(guān)鍵指標(biāo)評(píng)估，常用驗(yàn)證方法如下：
一、核心驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法
1、免疫印跡（WB）：最常用的活性評(píng)估方法
這是檢測(cè)抗體結(jié)合能力的金標(biāo)準(zhǔn)，核心思路是用同一批陽性樣本，對(duì)比抗體新批次與舊批次的信號(hào)差異。
（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
準(zhǔn)備固定濃度的陽性樣本：含目標(biāo)標(biāo)簽的重組蛋白（如純化的6×His-蛋白、GST-蛋白）或轉(zhuǎn)染后細(xì)胞裂解液，確保樣本濃度穩(wěn)定、無降解。
設(shè)置梯度上樣量：如10μg、20μg、40μg總蛋白，避免因上樣量過多掩蓋信號(hào)差異。
平行實(shí)驗(yàn)：同時(shí)使用新批次抗體（或已知活性的抗體作為參照）和待檢測(cè)的長(zhǎng)期使用抗體，嚴(yán)格控制孵育時(shí)間、溫度、洗膜條件一致。
增設(shè)陰性對(duì)照：無標(biāo)簽的空白細(xì)胞裂解液，排除非特異性結(jié)合的干擾。
（2）判斷指標(biāo)
信號(hào)強(qiáng)度：若待檢測(cè)抗體的條帶灰度值較參照抗體下降＞30%，且背景無明顯升高，提示抗體結(jié)合活性下降；
條帶特異性：若待檢測(cè)抗體出現(xiàn)額外雜帶、目標(biāo)條帶模糊，說明抗體特異性變差，可能伴隨活性下降；
最低檢測(cè)限：能檢測(cè)到目標(biāo)條帶的最低樣本上樣量，若待檢測(cè)抗體的最低檢測(cè)限顯著高于參照抗體，證明活性降低。
2、ELISA定量檢測(cè)：精準(zhǔn)評(píng)估結(jié)合親和力
適合定量判斷抗體與目標(biāo)標(biāo)簽的結(jié)合能力，比WB更靈敏，可早期發(fā)現(xiàn)活性衰減。
（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
包被抗原：將游離標(biāo)簽肽段（如6×His肽、Flag肽）或標(biāo)簽融合蛋白，按梯度濃度包被酶標(biāo)板。
梯度稀釋抗體：將待檢測(cè)抗體與參照抗體同時(shí)做倍比稀釋（如1:1000、1:2000…1:16000），加入酶標(biāo)板孵育。
檢測(cè)吸光度（OD值）：通過酶促反應(yīng)讀取信號(hào)，繪制抗體稀釋度-OD值曲線。
（2）判斷指標(biāo)
親和力：待檢測(cè)抗體的曲線平臺(tái)期OD值降低、EC??（半數(shù)有效濃度）升高，說明抗體結(jié)合能力下降；
線性范圍：活性正常的抗體線性范圍寬，活性下降的抗體線性范圍變窄，且低濃度下信號(hào)消失更快。
3、免疫熒光（IF/ICC）：細(xì)胞水平驗(yàn)證活性
適合后續(xù)需細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)的抗體，評(píng)估其在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合活性和特異性。
（1）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
準(zhǔn)備陽性細(xì)胞：轉(zhuǎn)染含目標(biāo)標(biāo)簽的質(zhì)粒，或用天然表達(dá)標(biāo)簽融合蛋白的細(xì)胞系。
平行染色：待檢測(cè)抗體與參照抗體用相同工作濃度孵育細(xì)胞，熒光二抗的濃度和孵育條件一致。
熒光成像：用相同曝光參數(shù)拍照，觀察熒光信號(hào)強(qiáng)度和定位。
（2）判斷指標(biāo)
信號(hào)強(qiáng)度：待檢測(cè)抗體的熒光亮度顯著低于參照抗體，且無背景升高，提示活性下降；
定位特異性：若信號(hào)彌散、與預(yù)期亞細(xì)胞定位不符，說明抗體特異性變差，可能因活性下降導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加。
二、輔助判斷的實(shí)用技巧
1、工作濃度依賴性測(cè)試
若需不斷提高抗體工作濃度（如從1:1000提高到1:200）才能達(dá)到原有信號(hào)強(qiáng)度，且背景無明顯升高，直接證明抗體活性下降——活性正常的抗體，在推薦工作濃度范圍內(nèi)即可穩(wěn)定出信號(hào)。
2、儲(chǔ)存條件回溯
抗體活性下降常與儲(chǔ)存不當(dāng)相關(guān)：若長(zhǎng)期反復(fù)凍融、未避光保存、或儲(chǔ)存溫度偏離說明書要求（如應(yīng)-20℃保存卻放4℃超過1個(gè)月），大概率會(huì)導(dǎo)致活性衰減，結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步確認(rèn)。
3、批次間一致性對(duì)比
保留新抗體到貨時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（如WB條帶灰度、ELISA的EC??值），長(zhǎng)期使用后定期對(duì)比，數(shù)據(jù)差異超過30%即可判定活性下降。
三、結(jié)果判定總結(jié)
滿足以下任意一條，即可判斷抗體活性下降，建議更換新批次抗體：
WB實(shí)驗(yàn)中，相同樣本上樣量下，信號(hào)灰度值較參照抗體下降＞30%；
ELISA實(shí)驗(yàn)中，EC??值升高超過50%，或平臺(tái)期OD值降低＞40%；
需提高2倍及以上工作濃度，才能達(dá)到原有實(shí)驗(yàn)信號(hào)強(qiáng)度。
