定制的抗體若需用于特殊實驗（如流式細胞術、免疫電鏡），需提前告知服務商哪些要求？
日期：2025-12-16 13:49:50
定制抗體時，若需用于流式細胞術、免疫電鏡這類特殊實驗，必須提前向服務商明確實驗專屬的技術要求，這些要求直接決定抗體的適用性，避免后續出現抗體不結合、背景過高或無法滿足實驗分辨率的問題。以下是針對兩類實驗需重點告知的內容：
一、用于流式細胞術（FlowCytometry）的核心要求
1、抗原的存在形式與樣本類型
明確抗原是細胞表面抗原還是細胞內抗原：表面抗原需抗體可穿透細胞膜外環境結合，無需破膜處理；細胞內抗原則要求抗體能耐受破膜劑（如TritonX-100、皂素），且不影響抗原結合位點。
提供樣本具體類型：如人源外周血單個核細胞（PBMC）、小鼠脾細胞、貼壁細胞系（如HeLa）等，服務商可據此調整免疫原設計（如選擇膜蛋白的胞外區片段，或確保抗體識別天然構象抗原）。
2、抗體的標記需求
流式實驗多需直接標記抗體，需明確熒光素類型：如FITC、PE、APC、PerCP-Cy5.5等，需說明是否需要串聯熒光素（注意其穩定性）；若需自行標記，需要求服務商提供未標記的純化抗體，并明確抗體的緩沖液（需無疊氮鈉、甘油等影響標記的成分）。
若做雙色/多色流式，需告知熒光素搭配方案，避免光譜重疊，服務商可協助選擇合適的標記策略。
3、特異性與背景控制要求
要求抗體無種屬交叉反應：如檢測人細胞抗原，需明確抗體不與小鼠、大鼠等實驗動物細胞結合；若樣本存在同源蛋白，需要求抗體能區分靶抗原與同源蛋白（提供同源蛋白序列，讓服務商做特異性驗證）。
強調低非特異性結合：流式對背景熒光敏感，需要求服務商采用親和純化（如抗原親和柱），而非僅用ProteinA/G純化，并提供陰性對照實驗數據（如無抗原細胞的染色結果）。
4、抗體的功能驗證要求
要求服務商提供流式染色驗證報告：包括抗體的最佳工作濃度、染色溫度（4℃避光vs室溫）、孵育時間，以及陽性率、熒光強度（MFI）等關鍵指標；若用于分選實驗，還需明確抗體無細胞毒性，避免影響分選后細胞的活性。
二、用于免疫電鏡（ImmunoelectronMicroscopy,IEM）的核心要求
1、抗原的定位與樣本制備方式
明確抗原是細胞內定位（如內質網、線粒體、細胞核）還是細胞外定位（如細胞膜表面、分泌泡），服務商可據此設計免疫原（如選擇抗原的胞內區片段，或確保抗體識別固定后的抗原表位）。
告知樣本的固定與包埋方案：免疫電鏡常用醛類固定（甲醛、戊二醛）或低溫包埋（如LRWhite樹脂），需要求抗體耐受固定劑處理——固定會改變抗原構象，因此必須強調抗體識別甲醛/戊二醛固定后的抗原，而非僅識別天然抗原。
2、抗體的標記與粒徑要求
免疫電鏡需抗體偶聯電子致密標記物，需明確標記類型：如膠體金顆粒（常用5nm、10nm、15nm粒徑），不同粒徑對應不同分辨率需求（小粒徑適合精細定位，大粒徑適合快速觀察）；若采用間接標記法（如二抗偶聯膠體金），需告知一抗的種屬來源（如鼠抗、兔抗），方便服務商匹配二抗。
若需進行冷凍免疫電鏡，需額外要求抗體在低溫（如-20℃、4℃）下穩定，且不與冷凍保護劑（如蔗糖）發生非特異性結合。
3、特異性與分辨率要求
要求抗體超高特異性：電鏡分辨率極高，非特異性結合會被清晰放大，需要求服務商通過阻斷實驗驗證（用游離抗原封閉抗體后，染色信號消失），并提供陰性對照樣本（如敲除靶抗原的細胞）的電鏡圖像。
明確無聚集性：抗體聚集會導致標記物成團，干擾定位判斷，需要求服務商提供的抗體純度＞95%，且經動態光散射（DLS）驗證無聚集。
4、抗體的緩沖液與保存要求
要求抗體緩沖液無顆粒雜質：避免緩沖液中的顆粒物在電鏡下形成假陽性信號，需采用超濾離心去除雜質，緩沖體系為中性（PBS或Tris-HCl），不含甘油、疊氮鈉等可能影響樣本制備的成分。
若需長期保存，需明確保存條件（如4℃短期或-80℃長期），服務商可調整抗體的穩定劑配方。
三、兩類實驗共通的必報要求
抗體的亞型與純化方式：如流式常用IgG1亞型（避免激活補體裂解細胞），免疫電鏡需抗原親和純化（而非ProteinA/G純化），需明確告知。
實驗的對照需求：要求服務商提供同型對照抗體（流式用于排除非特異性結合，免疫電鏡用于背景參考），并匹配相同的標記物。
批次間一致性：若需多次定制，要求服務商保證不同批次抗體的效價、特異性一致，并提供批次驗證報告。
