1、什么是ADC藥物內(nèi)化？

在細(xì)說DT3C是如何介導(dǎo)ADC藥物mAb內(nèi)化效率檢測之前，我們先來了解下什么是ADC藥物mAb內(nèi)化。ADC藥物由抗體、連接子和小分子毒素組成，是通過連接子（linker）將具有生物活性的小分子藥物偶聯(lián)至單克隆抗體上。單抗通過腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原的特異性和靶向性定位到腫瘤細(xì)胞表面，并通過內(nèi)吞/內(nèi)化作用進(jìn)入細(xì)胞，連接子在細(xì)胞內(nèi)低pH值或溶酶體蛋白作用下斷裂，釋放出具有活性的細(xì)胞毒藥物，破壞DNA或阻止腫瘤細(xì)胞分裂，從而對腫瘤細(xì)胞起到殺傷作用。該類藥物利用抗體的特異性靶向運(yùn)輸藥物分子到靶組織發(fā)揮作用，將細(xì)胞毒藥物強(qiáng)大的細(xì)胞殺傷能力集中于腫瘤細(xì)胞，降低對正常組織的毒副作用。在ADC設(shè)計(jì)研發(fā)過程中，首要的是藥物靶點(diǎn)的選擇。對于藥物靶點(diǎn)的選擇，除了要在腫瘤過度表達(dá)外，另一個(gè)重要因素是內(nèi)吞/內(nèi)化的效率，這是藥物釋放活性所必需的。抗體能否被內(nèi)化主要由靶點(diǎn)決定，而抗體內(nèi)化的效率則與抗原密度、抗體親和力以及抗體與抗原結(jié)合表位密切相關(guān)。同一靶點(diǎn)的不同抗體也會(huì)表現(xiàn)出不同的內(nèi)化效率。

2、DT3C如何介導(dǎo)ADC抗體藥物內(nèi)化效率體外檢測？

如前所述，ADC藥物中抗體能否被內(nèi)化是藥物效果評價(jià)的重要因素。這里你可能會(huì)疑問，ADC藥物中抗體的內(nèi)化與單純的抗體藥物內(nèi)化有區(qū)別嗎？為什么DT3C是專門針對的ADC藥物呢？首先，ADC藥物中抗體的內(nèi)化與單純的抗體藥物內(nèi)化肯定是有區(qū)別，首先ADC藥物的分子量是大于單純的抗體藥物的，相同條件下，二者的內(nèi)化效率肯定是不一樣的。其次，DT3C替代的是ADC藥物分子中的小分子藥物，是一種免疫毒素，mAb-DT3C偶聯(lián)物模擬的是ADC藥物。如下圖所示：mAb-DT3C偶聯(lián)復(fù)合物識別并結(jié)合細(xì)胞表面抗原后，mAb-DT3C-抗原復(fù)合物被內(nèi)化；然后DT3C被胞質(zhì)弗林蛋白酶（furin protease）切割，DT3C的催化結(jié)構(gòu)域被釋放到細(xì)胞質(zhì)中。DT3C的催化結(jié)構(gòu)域?qū)е卵由煲蜃?EF)-2的 ADP-核糖基化，隨后通過抑制蛋白質(zhì)翻譯機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞毒性。

圖1. Mechanism of antibody:DT3C-induced cytotoxicity

作為ADC藥物抗體內(nèi)化檢測工具，DT3C優(yōu)勢可總結(jié)為以下三點(diǎn)：

第一，mAb-DT3C偶聯(lián)物制備簡單，僅在室溫下孵育30min就能形成，而且在體外可以發(fā)揮患者給ADC藥物后的功能；

第二，DT3C可與來自不同物種（如人、小鼠、兔、山羊）的任何 IgG 結(jié)合，形成 mAb-DT3C 偶聯(lián)物，從而進(jìn)一步擴(kuò)大了DT3C作為mAb抗體內(nèi)化檢測工具的范圍；

第三，只有當(dāng)偶聯(lián)物被靶細(xì)胞內(nèi)化時(shí)，mAb-DT3C 偶聯(lián)物才會(huì)顯著降低細(xì)胞活力。

值得一提的是，在DT3C之前，Mab-ZAP是唯一能夠檢測細(xì)胞內(nèi)化mAb 效率工具。 Mab-ZAP由小鼠抗體和核糖體失活蛋白皂草素組成。當(dāng) mAb-Mab-ZAP 偶聯(lián)物被細(xì)胞內(nèi)化時(shí)，由于皂草素的毒性，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡。所以可以通過細(xì)胞的存活率來檢測mAb是否被細(xì)胞內(nèi)化。但是，不能排除Mab-ZAP本身在一定程度上可能降低mAb內(nèi)化效率，因?yàn)?Mab-ZAP是一種包含抗小鼠抗體的大分子。與Mab-ZAP相比，mAb-DT3C偶聯(lián)物的分子量穩(wěn)定且小于mAb-Mab-ZAP。并且，相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，mAb-DT3C內(nèi)化效率高于mAb-Mab-ZAP。

3、ADC藥物內(nèi)化途徑

目前，關(guān)于mAb-DT3C復(fù)合物內(nèi)化的具體途徑暫無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。結(jié)合常規(guī)的ADC藥物內(nèi)化途徑，一般來說，內(nèi)化又稱為內(nèi)吞，正常的內(nèi)吞作用可分為三個(gè)階段：芽的形成、膜的彎曲和囊泡的成熟和膜的斷裂并釋放到細(xì)胞質(zhì)中。ADC藥物內(nèi)化途徑可按是否依賴于網(wǎng)格蛋白分為：網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。非網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用又可進(jìn)一步分為：小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、小窩蛋白非依賴性載體蛋白/GPI-富集的早期內(nèi)區(qū)室（CLIC/GEEC）和巨胞飲作用。多種內(nèi)吞途徑有重疊的方面，因此內(nèi)吞的過程一般是高度靈活和復(fù)雜的。這里以小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞作用為例：

網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）包括幾個(gè)連續(xù)和部分重疊的步驟。對于質(zhì)膜上的一些受體而言，CME可以組成型發(fā)生；其他受體則需要配體或抗體結(jié)合后啟動(dòng)。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)吞衣殼蛋白開始聚集在質(zhì)膜的內(nèi)小葉上時(shí)，CME就開始了。衣殼蛋白通過從細(xì)胞質(zhì)中招募并與額外的蛋白質(zhì)接頭并相互作用，繼續(xù)組裝和生長。關(guān)鍵的銜接蛋白使膜彎曲，從而將內(nèi)化受體/配體集中到一個(gè)“網(wǎng)格蛋白包被坑”（CCP）中。在CCP頸部因CCP內(nèi)陷變大而收縮的點(diǎn)處會(huì)通過斷裂與質(zhì)膜分離。肌動(dòng)蛋白聚合有助于將CCP “向內(nèi)”拉入細(xì)胞質(zhì)，直到完全分裂，CCP 被釋放并變成網(wǎng)格蛋白包被的囊泡 (CCV)。最后，CCV外殼解體，CCV與內(nèi)體融合，分揀到確定的亞細(xì)胞位置，或者可以循環(huán)回細(xì)胞表面 ^[3]。