Mesothelin：癌癥免疫治療的后起之秀
日期：2019-09-24 14:14:17
間皮素（Mesothelin）又被稱為MSLN，它是由MSLN基因編碼的一種細胞表面糖蛋白。MSLN基因編碼一種前蛋白，經(jīng)蛋白水解后產(chǎn)生巨核細胞增強因子（megakaryocyte-potentiating factor，MPF）和間皮素兩種蛋白產(chǎn)物。巨核細胞增強因子是一種能夠刺激骨髓巨核細胞集落形成的細胞因子。間皮素是通過糖基磷脂酰肌醇錨定在細胞表面的蛋白。
間皮素是一種存在于正常間皮細胞上的分化抗原。在正常組織中很少表達，但是在間皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中均有高表達[1]，因此間皮素有可能成為癌癥治療的重要靶點。
1. 間皮素的發(fā)現(xiàn)
該蛋白首先由其與單克隆抗體K1[2]的反應活性被鑒定。間皮素能被單克隆抗體K1特異性識別。Chang等人從能與單克隆抗體K1發(fā)生反應的海拉(hela)細胞系的基因文庫中提取互補DNA克隆出間皮素基因。之所以將其命名為間皮素，因該基因編碼產(chǎn)生的膜結(jié)合蛋白主要位于正常間皮細胞表面。
2. 間皮素結(jié)構(gòu)特征
間皮素基因位于染色體16 p13.3，其基因全長8 kb，cDNA大小為213 bp，含有1884 bp的開放閱讀框，17個外顯子，編碼628個氨基酸。MSLN基因編碼一個71 KD的前體蛋白。該前體蛋白被弗林（furin）蛋白酶水解為兩個部分：一個可溶性31 kD N端蛋白稱為巨核細胞增強因子（megakaryocyte-potentiating factor，MPF）和一個40 kD膜結(jié)合片段稱為MSLN [3]。
圖1間皮素的成熟過程
目前認為間皮素至少存在3個異構(gòu)體，其中膜結(jié)合的間皮素是最常見的間皮素的變體；間皮素V-1具有額外的8個氨基酸，并且它也是與膜結(jié)合的形式；間皮素V-2具有修飾的COOH末端，是間皮素在蛋白酶的作用下水解，然后從細胞表面脫落而成，稱為可溶性間皮素相關肽（soluble mesothelin-related peptide，SMRP）[4]。
圖2 間皮素的異構(gòu)體
2.1 可溶性間皮素
間皮素的可溶形式是在氨基酸的600位刪除COOH-末端與膜結(jié)合的氨基酸發(fā)生移碼突變和轉(zhuǎn)錄過早終止而造成異常接合，影響間皮素與細胞膜的聯(lián)接。可溶性間皮素蛋白大小一般為42-45 kDa，其NH2-末端的氨基酸序列與膜結(jié)合間皮素相同。可溶性的間皮素的來源可能是膜結(jié)合間皮素的蛋白水解產(chǎn)物，也可能是通過可變剪接得到的。可溶性間皮素可以在一些間皮素陽性腫瘤患者的血中檢測到，測定血中的間皮素可用于某些疾病的診斷。
3. 間皮素的表達
間皮素可表達于正常胸膜、心包和腹膜的間皮細胞中，它在氣管，卵巢，睪丸，扁桃體和輸卵管的上皮細胞表面上表達最低。此外，作為與腫瘤侵襲有關的細胞表面抗原，它還在多種腫瘤組織中高表達，主要包括間皮瘤、卵巢和胰腺腺癌等。
3.1 間皮素在惡性腫瘤中的表達
MSLN被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中過度表達。目前在間皮瘤、卵巢癌、肺癌，食道癌，胰腺癌[5]，胃癌，膽管癌，子宮內(nèi)膜癌，胸腺癌，結(jié)腸癌和乳腺癌中均觀察到間皮素的過表達。
隨腫瘤亞型的不同，MSLN表達的頻率和分布而不同。
MSLN被發(fā)現(xiàn)表達在90％的上皮樣惡性胸膜間皮瘤，69％的肺腺癌，60％的乳腺癌和46％的食管癌中[6]。
在癌細胞內(nèi)，MSLN的表達可能是在腔/膜或細胞質(zhì)。不同類型的腫瘤MSLN的表達位置也有一定的差異。在間皮瘤腫瘤中，MSLN表達在細胞表面，呈均勻分布。在肺腺癌中，MSLN在細胞質(zhì)和細胞表面均有表達。在胃癌中，細胞質(zhì)表達比膜表達更為普遍。
MSLN還在甲狀腺、腎臟和滑膜肉瘤腫瘤等實體腫瘤中表達。
4. 間皮素的生物學功能
研究人員曾對MSLN基因敲除的小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)這些基因敲除小鼠表現(xiàn)出正常的發(fā)育、繁殖和血細胞計數(shù)[7]。這說明間皮素并非小鼠正常生長發(fā)育繁殖所必需。也正因為如此，到目前為止，間皮素的生物學功能目前仍不清楚。
有研究表明間皮素可能在粘附中發(fā)揮作用。隨著人們對腫瘤中間皮素的研究越來越深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。MSLN的過表達可激活NF-κB，MAPK和PI3K通路，并通過誘導MMP7和MMP9的激活和表達誘導細胞凋亡或促進細胞增殖，遷移和轉(zhuǎn)移。
MSLN異常表達在腫瘤細胞增殖、黏附及耐藥性方面起著重要作用。
圖3 間皮素的生物學功能
4.1 細胞增殖和細胞周期
在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，間皮素可以促進腫瘤細胞增殖。沉默胰腺癌腫瘤細胞中的間皮素基因可以抑制增殖。間皮素可以通過減緩細胞進入S期而抑制細胞周期[8]。間皮素的超量表達則會持續(xù)激活NF-κB信號通路并產(chǎn)生高水平的IL-6，從而激活轉(zhuǎn)錄蛋白Stat3，導致與細胞周期相關的cyclin E和周期蛋白依賴激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）的表達量增高。這最終加速了細胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)變。
4.2 細胞黏附和轉(zhuǎn)移
研究表明，轉(zhuǎn)染了間皮素的小鼠胚胎成纖維細胞3T3與未轉(zhuǎn)染的細胞相比，前者與培養(yǎng)皿附著更牢固、更難從細胞表面清除，這表明間皮素可能與細胞黏附有關。Rump等[9]在卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)，MSLN與CA125的高親和力相互作用導致細胞間的異型黏附，促進卵巢癌細胞系的轉(zhuǎn)移。MSLN的表達以及血清SMRP水平的升高與腫瘤的進展、分期的增加以及總體生存率的降低有關。
4.3 細胞耐藥
間皮素可以增加癌細胞對藥物的耐受性[10] [11]。
研究表明，間皮素的表達在卵巢癌化療敏感與耐藥患者中存在差異，在耐藥患者中間皮素表達顯著升高。下調(diào)間皮素表達后，卵巢癌耐藥細胞株的化療敏感性也明顯提高，在一定程度上逆轉(zhuǎn)了細胞耐藥。
研究發(fā)現(xiàn)，間皮素可能通過同時激活PI3K/AKT和MAPK/ERK兩個通路，阻斷了紫杉醇誘導的腫瘤細胞凋亡。這是間皮素所引起的細胞耐藥的原因之一。 間皮素基因可能受到Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑的分子的調(diào)節(jié)[12]。在卵巢癌和胰腺癌等Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑持續(xù)激活的腫瘤，間皮素表達水平增高。
5. 間皮素的應用
5.1 腫瘤治療的疫苗
間皮素是一種具有強烈免疫原性的蛋白質(zhì)，因此可用于制作抗腫瘤疫苗。 CRS-207是Aduro公司開發(fā)的一款以李斯特菌為載體的腫瘤疫苗，其作用機制是巨噬細胞將入侵細菌吞噬內(nèi)化加工處理，將間皮素抗原呈遞給T細胞，釋放淋巴因子，激活殺傷性T細胞靶向間皮素，最終引起表達間皮素的腫瘤細胞凋亡。
5.2 腫瘤診斷標志物
可溶性間皮素可在實體腫瘤患者血清中檢測到，這使其成為表達間皮素的腫瘤有價值的診斷工具。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可用于檢測血漿可溶性間皮素。可溶性間皮素自身缺乏敏感性及特異性，但與CA125聯(lián)合檢測可提高診斷效率[13]。間皮素結(jié)合其他卵巢腫瘤標志物可應用于卵巢癌的篩查。
5.3 腫瘤特異性免疫治療的靶點
鑒于間皮素在多種人類惡性腫瘤細胞中高度表達，在正常組織中很少表達，因而間皮素有望用于腫瘤特異性治療的靶點。目前針對MSLN設計了各種免疫治療策略，主要包括基于抗體療法和CAR-T的藥物的設計。
迄今報道的MSLN靶向免疫治療具有良好的安全性[14] [15]。MSLN是許多常見實體腫瘤中潛在的CAR靶點。
5.3.1 抗體類藥物
抗體類藥物主要通過抗體中和、抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴細胞介導的吞噬作用(ADCP)、抗體與效應分子(毒素或抑制劑)結(jié)合等方式來介導細胞凋亡或抑制細胞增殖，靶向殺傷腫瘤細胞。
matuximab（MORAb-009）是一種嵌合抗體，由抗間皮素抗體SS1單鏈可變區(qū)片段與人IgG1/κ恒定區(qū)組成，通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用（ADCC）殺傷腫瘤細胞，并可阻斷間皮素與CA125的相互作用[16]。
Anetumab Ravtansine (BAY94-9343)是一種抗體偶聯(lián)藥物，由抗間皮素抗體與美登素衍生物DM4（微管蛋白聚合酶抑制劑）組成[17]。BAY94-9343通過抗間皮素抗體與腫瘤細胞表面間皮素結(jié)合后，可被內(nèi)化進入溶酶體然后釋放DM4殺傷腫瘤細胞。
DMOT4039A是由人源化IgG1抗間皮素單克隆抗體h7D9 v3（α-MSLN）與抗微管蛋白藥物monomethyl auristatin E（MMAE）通過二肽連接而成的抗體偶聯(lián)藥物。DMOT4039A主要通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞作用進入溶酶體并釋放出MMAE，隨后與細胞質(zhì)的微管蛋白結(jié)合從而阻滯細胞周期的G2/M期，使細胞生長停滯、誘導凋亡。
MDX-1204是由全人源間皮素抗體（MDX-1383）與一種烷化劑duocarmycin（MED2460）偶聯(lián)而成的抗體偶聯(lián)藥物[18]。MDX-1204與間皮素的結(jié)合阻斷其與CA125之間的相互作用。MDX-1204與間皮素結(jié)合后被細胞內(nèi)化并釋放出小分子藥物MED2460，MED2460通過與DNA小溝結(jié)合，引起DNA不可逆烷基化，進而破壞核酸結(jié)構(gòu)，最終導致細胞死亡。
- Amatuximab
- Anetumab Ravtansine
- DMOT4039A
- MDX-1204
5.3.2 免疫毒素
SS1P是重組免疫毒素，它是由小鼠抗間皮素抗體的可變區(qū)片段與假單胞菌外毒素38（PE38）融合而成[19]。SS1(dsFv)PE38是一種重組的抗間皮素免疫毒素，目前正在對間皮素表達腫瘤患者進行臨床評估。許多基于MSLN抗體SS1或其他改良和人性化版本的藥物已被開發(fā)用于靶向治療。
5.3.3 嵌合抗原受體T細胞療法
嵌合抗原受體T細胞（CAR）通常由細胞外抗原識別域(通常由抗體的單鏈可變片段(single chain variable fragment, scFv)衍生而來)、作為細胞質(zhì)膜錨定的跨膜域和傳遞T細胞活化信號的細胞內(nèi)域組成。
圖4 嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)
第一代CAR只包含一個細胞內(nèi)信號域，通常是CD3ζ鏈，這足以啟動T細胞活化，但只產(chǎn)生短期增殖活性和低水平的細胞毒性。
第二代CAR通過加入另一種共刺激分子(CD28、4-1BB或OX40)大大提高了效能。
第三代CAR含有兩個共刺激結(jié)構(gòu)域（CD28，4-1BB，TLR2或DAP10）和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，在細胞增殖、細胞毒性、持久性和腫瘤抑制效果方面更優(yōu)。
第四代CAR，可以分泌細胞因子或其他效應分子，如IL-12，IL-15，IL-7或CCL19，以調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。
關于CAR-T的詳細信息，這篇文章有更為詳細的介紹：細胞免疫治療-CAR-T細胞療法。
圖5 MSLN CAR的改進
間皮素CAR-T細胞治療在間皮瘤、卵巢癌、肺癌小鼠移植模型中取得了令人鼓舞的結(jié)果，相應的一些臨床試驗也已獲批，目前正在進行中[20] [21]。
提高CAR-T細胞的效率，是CAR-T療法中的主要問題之一。這主要需要從以下幾個方面著手：
促進CAR-T細胞浸潤；
增強CAR-T細胞的功能持久性；
增強CAR-T細胞以克服腫瘤微環(huán)境中遇到的抑制信號；
通過預防靶向/非腫瘤毒性來提高安全性。
將MSLN CAR-T細胞設計成過度表達趨化因子受體CCR2B被證明可增強T細胞向?qū)嶓w腫瘤的轉(zhuǎn)運。因為間皮瘤細胞高度表達其趨化因子配體CCL2，而T細胞僅表達少量CCR2B。CCR2B過表達顯著提高了系統(tǒng)給藥的治療效率。
為鼎力協(xié)助科研和藥企人員針對Mesothelin（MSLN）的在腫瘤中的臨床應用研究，CUSABIO推出MSLN活性蛋白（Code：CSB-MP015044HUc9），助力您在MSLN機制方面的研究或其潛在臨床價值的探索。
華美 CUSABIO MSLN 蛋白
Recombinant Human Mesothelin (MSLN), partial (Active) Code: CSB-MP015044HUc9
by SDS-PAGE
The high purity is greater than 95% as determined by SDS-PAGE.
Immobilized MSLN at 2 μg/ml can bind Anti-MSLN rabbit monoclonal antibody. The EC50 of the MSLN protein is 2.657-3.177 ng/ml.
Immobilized MUC16 (CSB-MP704410HU3c7) at 10 μg/ml can bind MSLN. The EC50 is 460.7-662.2 ng/ml.
參考文獻：
[1] Paolo B, Sara C. Amatuximab and novel agents targeting mesothelin for solid tumors [J]. OncoTargets and Therapy, 2017, Volume 10: 5337-5353.
[2] Chang K. Characterization of the antigen (CAK1) recognized by monoclonal antibody K1 present on ovarian cancers and normal mesothelium [J]. Cancer Res, 1992, 52(1): 181-186.
[3] Manzanares M, Campbell D J W, Maldonado G T, et al. Overexpression of periostin and distinct mesothelin forms predict malignant progression in a rat cholangiocarcinoma model [J]. Hepatol Commun, 2018, 2(2): 155-172.
[4] Burt B M, Lee H S, Rosen V L D, et al. Soluble Mesothelin-Related Peptides to Monitor Recurrence After Resection of Pleural Mesothelioma [J]. Annals of Thoracic Surgery, 2017, 104(5): 1679.
[5] Argani P. Mesothelin is overexpressed in the vast majority of ductal adenocarcinomas of the pancreas: Identification of a new pancreatic cancer marker by serial analysis of gene expression (SAGE) [J]. Clin Cancer Res, 2001, 7.
[6] Morello A, Sadelain M, Adusumilli P S. Mesothelin-Targeted CARs: Driving T cells to Solid Tumors [J]. Cancer Discovery, 2015, 6(2).
[7] Bera T K, Pastan I. Mesothelin Is Not Required for Normal Mouse Development or Reproduction [J]. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20(8): 2902-2906.
[8] Guadalupe A M, Beate P, Calderón-Aranda Emma S, et al. Biomarkers for Predicting Malignant Pleural Mesothelioma in a Mexican Population [J]. International Journal of Medical Sciences, 2018, 15(9): 883-891.
[9] Rump A, Morikawa Y, Tanaka M, et al. Binding of Ovarian Cancer Antigen CA125/MUC16 to Mesothelin Mediates Cell Adhesion [J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(10): 9190-9198.
[10] Bharadwaj U, Marin-Muller C, Li M, et al. Mesothelin confers pancreatic cancer cell resistance to TNF-α-induced apoptosis through Akt/PI3K/NF-κB activation and IL-6/Mcl-1 overexpression [J]. Molecular Cancer, 2011, 10(1): 106.
[11] Cheng W F, Huang C Y, Chang M C, et al. High mesothelin correlates with chemoresistance and poor survival in epithelial ovarian carcinoma [J]. BRITISH JOURNAL OF CANCER, 2009, 100(7): 1144-1153.
[12] Moon R T, Prieve M G. Stromelysin-1 and mesothelin are differentially regulated by Wnt-5a and Wnt-1 in C57mg mouse mammary epithelial cells [J]. BMC Developmental Biology, 2003, 3(1): 1-10.
[13] Bast R C. Status of tumor markers in ovarian cancer screening [J]. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2003, 21(10 Suppl): 200s.
[14] Villena-Vargas J, Adusumilli P S. Mesothelin-targeted immunotherapies for malignant pleural mesothelioma [J]. Annals of Cardiothoracic Surgery, 2012, 1(4): 466.
[15] Pastan I, Hassan R. Discovery of Mesothelin and Exploiting It as a Target for Immunotherapy [J]. Cancer Research, 2014, 74(11): 2907-2912.
[16] Hassan R, Ebel W, Routhier E L, et al. Preclinical evaluation of MORAb-009, a chimeric antibody targeting tumor-associated mesothelin [J]. Cancer Immunity, 2007, 7: 20.
[17] Grosso F, Scagliotti G V. Systemic treatment of malignant pleural mesothelioma [J]. Future Oncology, 2012, 8(3): 293-305.
[18] Pogue S, Chen X, Alexander S, et al. Fully human antimesothelin antibody drug conjugate demonstrates antitumor effects in human lung cancer models [J]. Clinical Cancer Research, 2008, 14(15 Supplement): A13-A13.
[19] Kolyvas E, Rudloff M, Poruchynsky M, et al. Mesothelin-targeted immunotoxin RG7787 has synergistic anti-tumor activity when combined with taxanes [J]. Oncotarget, 2017, 8(6): 9189.
[20] Beatty GL, Haas AR, Maus MV, et al. Mesothelin-Specific Chimeric Antigen Receptor mRNA-Engineered T Cells Induce Antitumor Activity in Solid Malignancies [J]. Cancer Immunology Research, 2015, 3(2): 217.
[21] Adusumilli P S, Cherkassky L, Villena-Vargas J, et al. Regional delivery of mesothelin-targeted CAR T cell therapy generates potent and long-lasting CD4-dependent tumor immunity [J]. Science Translational Medicine, 2014, 6(261): 261ra151-261ra151.
