ELISA試劑盒的抗體偶聯(lián)效率對(duì)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度及檢測(cè)下限的影響規(guī)律是什么，如何建立抗體偶聯(lián)效率的質(zhì)控方法？
日期：2025-11-20 14:25:34
抗體偶聯(lián)效率與檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度呈正相關(guān)（達(dá)到飽和值后趨于平穩(wěn)），與檢測(cè)下限呈負(fù)相關(guān)；質(zhì)控方法需圍繞“量化偶聯(lián)程度+驗(yàn)證功能活性”雙核心建立。
一、偶聯(lián)效率對(duì)檢測(cè)性能的影響規(guī)律
對(duì)檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度：低偶聯(lián)效率時(shí)，信號(hào)隨偶聯(lián)率升高而顯著增強(qiáng)，酶分子與抗體結(jié)合數(shù)量增加，催化底物反應(yīng)更充分；當(dāng)偶聯(lián)率達(dá)到飽和（每分子抗體結(jié)合3-5個(gè)酶分子為宜），再升高偶聯(lián)率，信號(hào)增長(zhǎng)平緩甚至下降，過量酶會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加。
對(duì)檢測(cè)下限：偶聯(lián)效率過低，低濃度抗原對(duì)應(yīng)的信號(hào)弱，難以與背景區(qū)分，檢測(cè)下限升高（靈敏度下降）；偶聯(lián)效率達(dá)適宜范圍時(shí)，檢測(cè)下限降至最低；偶聯(lián)率過高，背景信號(hào)上升，反而可能抬高檢測(cè)下限。
二、抗體偶聯(lián)效率的質(zhì)控方法建立
1、量化偶聯(lián)率的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法
分光光度法（最常用）：通過測(cè)定抗體（280nm）和酶（如HRP測(cè)403nm）的特征吸收峰，代入公式計(jì)算偶聯(lián)率，HRP-抗體偶聯(lián)率宜控制在1.5-4.0。
凝膠過濾層析法：分離未結(jié)合的游離酶與偶聯(lián)物，通過峰面積占比量化偶聯(lián)效率，要求游離酶占比≤10%。
放射性標(biāo)記法：用放射性核素標(biāo)記酶或抗體，通過計(jì)數(shù)結(jié)合態(tài)與游離態(tài)的放射性強(qiáng)度，計(jì)算偶聯(lián)率，適用于高精度質(zhì)控。
2、功能活性驗(yàn)證（關(guān)鍵質(zhì)控環(huán)節(jié)）
信號(hào)強(qiáng)度驗(yàn)證：用固定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行ELISA檢測(cè)，記錄吸光度值，需符合試劑盒預(yù)設(shè)的信號(hào)范圍（如中濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度1.0-2.0）。
靈敏度驗(yàn)證：檢測(cè)試劑盒說明書規(guī)定的最低檢測(cè)限（LOD）樣本，需能穩(wěn)定檢出且相對(duì)偏差≤±20%。
特異性驗(yàn)證：檢測(cè)陰性對(duì)照和交叉反應(yīng)抗原，陰性對(duì)照吸光度需≤0.1（或符合試劑盒標(biāo)準(zhǔn)），交叉反應(yīng)率≤5%。
3、質(zhì)控流程規(guī)范
批內(nèi)質(zhì)控：每批偶聯(lián)產(chǎn)物隨機(jī)抽取3-5個(gè)樣本，檢測(cè)偶聯(lián)率和功能活性，變異系數(shù)（CV）≤10%。
批間質(zhì)控：建立歷史數(shù)據(jù)基線，新批次偶聯(lián)率需在基線±15%范圍內(nèi)，功能活性與標(biāo)準(zhǔn)批次無顯著差異（t檢驗(yàn)P>0.05）。
穩(wěn)定性質(zhì)控：將偶聯(lián)物按儲(chǔ)存條件放置，定期檢測(cè)偶聯(lián)率和活性，確保有效期內(nèi)性能達(dá)標(biāo)。
