使用ELISA檢測試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，線性不佳該排查哪些問題？
日期：2025-10-17 11:37:07
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線線性不佳，需從試劑配制、加樣操作、孵育反應(yīng)、檢測過程四個核心環(huán)節(jié)排查，這是定位問題的關(guān)鍵方向。
1、試劑配制環(huán)節(jié)：核心是確保標(biāo)準(zhǔn)品濃度準(zhǔn)確
標(biāo)準(zhǔn)品濃度是繪制曲線的基礎(chǔ)，濃度不準(zhǔn)會直接導(dǎo)致線性偏差。
檢查標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶：確認是否嚴格按照說明書要求的溶劑（如特定稀釋液、蒸餾水）和體積復(fù)溶，復(fù)溶后是否充分混勻，避免局部濃度不均。
核查稀釋過程：排查梯度稀釋時是否出現(xiàn)“稀釋錯誤”，比如移液體積偏差、稀釋液用量錯誤，或未更換吸頭導(dǎo)致交叉污染。
確認試劑有效性：查看標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)抗體、底物等是否在有效期內(nèi)，是否按要求儲存（如2-8℃冷藏或-20℃冷凍），反復(fù)凍融會導(dǎo)致試劑失效。
2、加樣操作環(huán)節(jié)：重點排查操作誤差
加樣過程的微小偏差會放大到標(biāo)準(zhǔn)曲線上，尤其影響低濃度或高濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值。
檢查移液準(zhǔn)確性：確認移液器是否校準(zhǔn)，使用時是否按正確手法操作（如慢吸慢放），避免因操作過快產(chǎn)生氣泡或體積不準(zhǔn)。
排查交叉污染：加樣時是否及時更換吸頭，尤其是在加完高濃度標(biāo)準(zhǔn)品后，未換吸頭會污染低濃度標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致低濃度吸光度偏高。
確認加樣順序：是否按標(biāo)準(zhǔn)品濃度從低到高或從高到低順序加樣，無序加樣若伴隨吸頭污染，會增加誤差風(fēng)險。
3、孵育反應(yīng)環(huán)節(jié)：關(guān)鍵是保證反應(yīng)條件一致
孵育條件不均會導(dǎo)致各孔反應(yīng)程度不同，破壞曲線線性。
檢查孵育溫度：確認孵育箱實際溫度是否與說明書一致，是否存在箱內(nèi)溫度不均（如靠近箱壁的孔溫度偏低），可使用溫度計實地測量。
核查孵育時間：是否嚴格遵循說明書的孵育時長，提前終止或延遲孵育會導(dǎo)致酶促反應(yīng)不充分或過度，影響吸光度值。
確認反應(yīng)板密封：孵育時是否加蓋板膜或放入濕盒，未密封會導(dǎo)致孔內(nèi)液體蒸發(fā)，使試劑濃度升高，尤其高濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度會異常偏高。
4、檢測過程環(huán)節(jié)：重點關(guān)注洗滌和底物反應(yīng)
洗滌不徹底或底物反應(yīng)異常，會干擾吸光度檢測結(jié)果，導(dǎo)致曲線線性差。
檢查洗滌步驟：確認洗滌液是否按要求稀釋，洗滌次數(shù)和浸泡時間是否符合說明書，洗滌不徹底會殘留未結(jié)合的酶標(biāo)抗體，導(dǎo)致背景值升高；洗滌過度則會洗去特異性結(jié)合的復(fù)合物，導(dǎo)致吸光度偏低。
核查底物反應(yīng)：確認底物是否在有效期內(nèi)，是否按要求避光儲存，底物反應(yīng)時間是否準(zhǔn)確，反應(yīng)終止液是否及時加入、體積是否一致，終止不及時會導(dǎo)致吸光度值偏高且不穩(wěn)定。
檢查儀器狀態(tài)：確認酶標(biāo)儀是否校準(zhǔn)，檢測波長是否與說明書一致（如450nm為主波長，630nm為參比波長），儀器光源強度不足會導(dǎo)致檢測靈敏度下降，影響低濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度讀取。
