樣本在保存過程中（如冷藏、冷凍）會對ELISA檢測結果產生哪些影響？
日期：2025-09-29 13:57:39
樣本在冷藏（通常2-8℃）或冷凍（通常-20℃/-80℃）保存過程中，可能通過樣本成分降解、結構改變、干擾物質釋放等方式影響ELISA檢測結果的準確性，具體影響及機制如下：
一、冷藏保存（2-8℃）對ELISA檢測結果的影響
冷藏屬于短期保存方式（通常建議數小時至1周，具體需參考樣本類型和檢測指標），雖對樣本的破壞較冷凍小，但仍可能引發以下問題：
1、酶活性變化與成分降解
樣本中內源性的蛋白酶（如血清中的絲氨酸蛋白酶、組織樣本中的基質金屬蛋白酶）在冷藏條件下未完全失活，仍會緩慢降解靶標蛋白（如檢測的抗原為細胞因子、抗體、酶類）。例如，血清中的IL-6、TNF-α等細胞因子，若冷藏時間超過48小時，可能因蛋白酶水解導致抗原濃度降低，最終使ELISA檢測的吸光度值下降，出現“假陰性”或檢測值偏低。
此外，樣本中的酯酶、氧化酶等還可能破壞ELISA試劑中的酶標記物（如HRP、AP），若樣本保存不當（如反復取出室溫放置），酶標記物活性降低會直接影響顯色反應，導致結果不準確。
2、微生物污染與代謝干擾
冷藏無法完全抑制微生物（細菌、真菌）的生長，若樣本（如全血、尿液、組織勻漿）未添加防腐劑（如疊氮鈉、蛋白酶抑制劑），微生物會緩慢繁殖并代謝產生酸性物質、毒素或酶類。這些代謝產物可能：
改變樣本pH值（ELISA反應對pH敏感，通常需在中性環境下進行），影響抗原-抗體特異性結合；
非特異性吸附在ELISA板的包被孔上，或與檢測抗體交叉反應，導致背景信號升高（吸光度值偏高），出現“假陽性”。
3、樣本物理狀態改變
部分樣本（如含脂蛋白較高的血清、乳汁）在冷藏時可能出現蛋白析出（如低密度脂蛋白沉淀），或因溫度降低導致樣本黏度增加。析出的蛋白顆粒會附著在ELISA板孔壁，干擾抗原與包被抗體的結合，同時在洗滌步驟中難以徹底去除，導致非特異性顯色，使檢測結果偏高。
二、冷凍保存（-20℃/-80℃）對ELISA檢測結果的影響
冷凍屬于長期保存方式（通常數周至數月，-80℃可保存更久），但反復凍融和冷凍過程中的物理化學變化是影響結果的核心因素：
1、反復凍融導致靶標物質破壞
樣本冷凍時，細胞內或樣本中的水分會形成冰晶，冰晶膨脹可能破壞細胞結構（如組織樣本、細胞裂解液），導致胞內的蛋白酶、核酸酶大量釋放；同時，反復凍融（如樣本從-80℃取出后未及時分裝，室溫融化后再次冷凍）會加劇冰晶對靶標蛋白的機械損傷——蛋白的空間結構被破壞（如抗原的表位變性），無法與抗體特異性結合，最終導致檢測值顯著降低（甚至檢測不到）。
例如，檢測全血中的血紅蛋白、組織樣本中的磷酸化蛋白時，反復凍融3次以上，靶標蛋白的降解率可超過30%，直接影響ELISA結果的可靠性。
2、冷凍導致樣本成分聚集或沉淀
冷凍過程中，樣本中的蛋白（如血清中的白蛋白、免疫球蛋白）可能因溶解度降低而發生聚集，形成不溶性沉淀；此外，樣本中的鹽類（如NaCl、KCl）也可能析出結晶。這些聚集物或結晶會：
堵塞ELISA板的微孔，影響試劑（如酶標抗體、底物）的均勻分布；
非特異性結合檢測抗體，導致背景信號升高，或競爭結合位點使特異性信號降低，造成結果偏差。
3、低溫對抗體結合能力的間接影響
雖然ELISA檢測在室溫或37℃下進行，但樣本若長期冷凍（尤其是-20℃以下），部分靶標抗原可能發生“低溫變性”——雖一級結構（氨基酸序列）未變，但二級/三級結構（如α-螺旋、抗原表位構象）改變，導致其與ELISA試劑中的抗體（尤其是識別構象表位的單克隆抗體）的結合親和力下降。例如，檢測膜蛋白、糖蛋白等依賴構象的抗原時，長期冷凍可能使檢測值偏低，而對識別線性表位的抗體影響較小。
4、樣本體積變化與濃度偏差
冷凍時樣本中的水分膨脹，若保存容器（如EP管）密封性差，可能導致樣本解凍后體積輕微減少（水分揮發），或外界污染物（如容器內壁的雜質）溶入樣本，間接改變靶標抗原的濃度。例如，尿液樣本冷凍后若容器滲漏，解凍后可能因濃縮導致抗原濃度偏高，或因污染引入干擾物質。
三、不同樣本類型的保存敏感性差異
不同樣本（血清、血漿、組織勻漿、細胞上清等）對冷藏/冷凍的耐受性不同，影響程度也存在差異：
血清/血漿：短期冷藏（24小時內）影響較小，但長期冷藏（>72小時）易因蛋白酶降解靶標；冷凍時需避免反復凍融，建議分裝后-80℃保存（尤其檢測細胞因子、激素等小分子抗原時）。
組織勻漿/細胞裂解液：含大量蛋白酶和核酸酶，冷藏保存不超過24小時，冷凍前需添加蛋白酶抑制劑（如PMSF、EDTA），否則靶標蛋白降解速度快，易導致檢測結果偏低。
尿液/腦脊液：成分較稀釋，冷藏時易滋生微生物，需添加防腐劑；冷凍時可能出現鹽類沉淀，解凍后需充分離心（3000g×5分鐘）去除沉淀，否則干擾顯色。
四、樣本保存對ELISA結果的核心影響
無論是冷藏還是冷凍，最終均可能通過靶標濃度降低（降解）、非特異性干擾增加（沉淀/污染）、抗原-抗體結合能力下降（構象改變）這三類機制影響結果，表現為“檢測值偏低（假陰性）”“檢測值偏高（假陽性）”或“結果重復性差”。因此，ELISA檢測前需嚴格遵循樣本保存規范：短期用冷藏（2-8℃，<24小時），長期用分裝冷凍（-80℃，避免反復凍融），并根據樣本類型添加防腐劑或蛋白酶抑制劑，以減少保存過程中的誤差。
