加完終止液后，需多久內(nèi)完成ELISA試劑盒讀數(shù)？
日期：2025-09-02 16:58:31
在ELISA實(shí)驗(yàn)中，加完終止液后需嚴(yán)格控制讀數(shù)時(shí)間，核心原則是 “在終止反應(yīng)后的‘穩(wěn)定窗口期’內(nèi)完成讀數(shù)”，通常要求15-30分鐘內(nèi)完成，具體需以試劑盒說明書為準(zhǔn)（不同底物系統(tǒng)的穩(wěn)定時(shí)間差異較大）。以下從 “時(shí)間要求的核心原因”“不同底物的具體差異”“操作注意事項(xiàng)” 三方面詳細(xì)說明：
一、為什么必須限時(shí)讀數(shù)？—— 終止液的作用與信號(hào)穩(wěn)定性原理
一、為什么必須限時(shí)讀數(shù)？—— 終止液的作用與信號(hào)穩(wěn)定性原理
終止液的核心功能是立即終止酶（如HRP、AP）與底物的催化反應(yīng)，使所有反應(yīng)孔的 “顯色信號(hào)” 停留在同一時(shí)間點(diǎn)，確保讀數(shù)結(jié)果能反映樣本中目標(biāo)分子的真實(shí)濃度。但終止后，顯色信號(hào)并非永久穩(wěn)定，會(huì)因以下原因隨時(shí)間推移發(fā)生變化，導(dǎo)致結(jié)果偏差：
底物氧化/降解：終止液雖停止酶促反應(yīng)，但顯色產(chǎn)物（如 TMB 的藍(lán)色產(chǎn)物、OPD的黃色產(chǎn)物）在室溫下仍可能被空氣中的氧氣氧化，或因 pH 變化（終止液多為強(qiáng)酸 / 強(qiáng)堿，如硫酸、氫氧化鈉）緩慢降解，導(dǎo)致吸光度（OD值）逐漸升高或降低；
非特異性反應(yīng)殘留：若終止不徹底（或終止后放置過久），微量未被完全抑制的酶可能繼續(xù)微弱催化反應(yīng)，導(dǎo)致信號(hào)漂移；
溶液狀態(tài)變化：部分底物（如TMB）的終止產(chǎn)物在長期放置后可能出現(xiàn)輕微沉淀，導(dǎo)致OD值假性升高，或因蒸發(fā)導(dǎo)致濃度變化（尤其開放式孵育時(shí)）。
限時(shí)讀數(shù)的目的是捕捉 “反應(yīng)完全終止、信號(hào)尚未發(fā)生顯著變化” 的穩(wěn)定狀態(tài)，避免信號(hào)漂移影響結(jié)果準(zhǔn)確性。
二、不同底物系統(tǒng)的讀數(shù)時(shí)間差異（以常見底物為例）
ELISA常用的酶 - 底物系統(tǒng)主要有HRP（辣根過氧化物酶）-TMB/OPD和AP（堿性磷酸酶）-pNPP，不同系統(tǒng)的終止后信號(hào)穩(wěn)定時(shí)間差異較大，需優(yōu)先遵循試劑盒說明書的專屬要求：
| 酶 - 底物系統(tǒng) | 終止液類型 | 終止后信號(hào)穩(wěn)定時(shí)間（常規(guī)范圍） | 讀數(shù)時(shí)間建議 | 信號(hào)變化趨勢(shì)（超時(shí)后） |
| HRP-TMB | 稀硫酸（1-2M） | 15-30分鐘 | 加終止液后立即混勻，10 分鐘內(nèi)開始讀數(shù)，30 分鐘內(nèi)完成 | 隨時(shí)間延長，藍(lán)色→黃色產(chǎn)物可能緩慢氧化，OD值輕微升高；超過 30 分鐘可能出現(xiàn)沉淀，OD值波動(dòng) |
| HRP-OPD | 稀硫酸（1-2M） | 10-20分鐘 | 加終止液后 15 分鐘內(nèi)必須完成讀數(shù) | 黃色產(chǎn)物對(duì)光敏感，室溫下易褪色，OD值隨時(shí)間顯著降低 |
| AP-pNPP | 氫氧化鈉（0.5-1M） | 20-40分鐘 | 加終止液后 20-35 分鐘內(nèi)讀數(shù) | 黃色產(chǎn)物穩(wěn)定性略優(yōu)于OPD，但超過 40分鐘后OD值可能因 pH 適應(yīng)而輕微下降 |
關(guān)鍵提醒：試劑盒說明書是最高準(zhǔn)則。部分廠商會(huì)根據(jù)自家試劑的配方（如酶的純度、底物濃度、穩(wěn)定劑成分）調(diào)整穩(wěn)定時(shí)間，例如某些優(yōu)化后的TMB底物可允許40分鐘內(nèi)讀數(shù)，而部分OPD試劑盒可能要求 10 分鐘內(nèi)完成。
三、確保讀數(shù)準(zhǔn)確性的操作注意事項(xiàng)
1、加終止液后立即混勻
終止液需與反應(yīng)孔內(nèi)的底物溶液充分混勻（可通過輕微震蕩酶標(biāo)板或用移液器緩慢吹打 1-2 次），避免局部終止不徹底導(dǎo)致的 “孔內(nèi)信號(hào)不均”—— 若混勻不充分，同一孔內(nèi)不同區(qū)域的 OD 值差異可能超過 10%，直接影響結(jié)果。
2、避免強(qiáng)光直射
2、避免強(qiáng)光直射
部分顯色產(chǎn)物（如 OPD、TMB 的氧化產(chǎn)物）對(duì)光敏感，加終止液后需將酶標(biāo)板置于避光處（如蓋上酶標(biāo)板蓋子、放在暗盒中），待所有孔加完終止液后立即讀數(shù)，防止光照導(dǎo)致的信號(hào)降解。
3、統(tǒng)一讀數(shù)時(shí)間點(diǎn)
若檢測(cè)樣本量較大（如 96 孔板滿板），需規(guī)劃好加終止液的順序（如 “從第一列到第十二列” 依次添加），確保所有孔的 “終止后放置時(shí)間” 盡可能一致（差異不超過 5 分鐘）。例如：每加完一列（8 孔）耗時(shí) 1 分鐘，96 孔需 12 分鐘，加完最后一列后立即開始讀數(shù)，此時(shí)第一列的放置時(shí)間約為 12 分鐘，仍在 15-30 分鐘的穩(wěn)定窗口內(nèi)。
4、異常情況處理
若因儀器故障等原因無法在規(guī)定時(shí)間內(nèi)讀數(shù)，需記錄實(shí)際延遲時(shí)間，并在數(shù)據(jù)分析時(shí)備注（但延遲超過 30 分鐘的結(jié)果通常不建議采用，需考慮重新實(shí)驗(yàn)）；若發(fā)現(xiàn)部分孔出現(xiàn)沉淀，需先確認(rèn)是否為正常現(xiàn)象（如部分試劑盒底物終止后可能有輕微絮狀物），若沉淀影響讀數(shù)，需聯(lián)系廠商技術(shù)支持判斷是否需重新檢測(cè)。
加完終止液后的讀數(shù)時(shí)間需嚴(yán)格結(jié)合 “底物類型” 和 “試劑盒說明書”，核心是在 15-30 分鐘的常規(guī)穩(wěn)定窗口內(nèi)完成，同時(shí)通過 “充分混勻、避光、統(tǒng)一時(shí)間點(diǎn)” 等操作，最大程度保證讀數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
