抗體標記ELISA試劑盒HRP與AP標記物的選擇原則?
日期:2025-07-22 15:00:37
在ELISA試劑盒中,辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AP)是最常用的兩種酶標記物,其選擇需結合檢測需求、樣本特性、實驗條件及底物特性等綜合判斷。以下從兩者的核心特性對比出發,詳細說明選擇原則:

一、HRP與AP的核心特性對比
特性 | 辣根過氧化物酶(HRP) | 堿性磷酸酶(AP) |
來源與穩定性 | 來源于辣根,分子量小(~44 kDa),性質穩定,易純化,保存成本低。 | 來源于小牛腸或細菌,分子量大(~140 kDa),對溫度和 pH 更敏感,純化難度稍高。 |
催化機制 | 以 H?O?為底物,催化供氫體(如 TMB)氧化顯色。 | 催化磷酸酯底物(如 pNPP)水解,釋放顯色基團(如對硝基苯酚)。 |
反應速度 | 反應快速,顯色在 15-30 分鐘內可達穩定平臺期。 | 反應較慢,顯色需 30-60 分鐘,甚至更長時間達到平臺期。 |
底物類型 | 以比色底物(TMB、OPD)為主,也可用于化學發光(如 ECL)。 | 以比色底物(pNPP)為主,化學發光底物(如 AMPPD)靈敏度更高。 |
信號強度 | 比色信號中等,化學發光模式下靈敏度較高。 | 比色信號強,化學發光模式下靈敏度顯著高于 HRP(可達 pg 級檢測)。 |
干擾因素 | 易受樣本中內源性過氧化物、還原劑(如維生素 C)或 H?O?污染影響。 | 易受樣本中內源性磷酸酶、金屬離子(如 Zn²?、Mg²?)或磷酸鹽抑制。 |
成本與普及度 | 價格低廉,試劑易獲取,是 ELISA 最常用標記物。 | 價格稍高,試劑成本略高,普及度略低于 HRP。 |

二、選擇原則:關鍵因素與適用場景
1. 檢測靈敏度需求
優先選AP的場景:若目標 analyte 濃度極低(如 pg 級或更低),需超高靈敏度檢測(如激素、細胞因子的微量檢測),AP更具優勢。其化學發光底物(如AMPPD)的信號放大效應更強,檢測限通常比HRP低 1-2 個數量級。
優先選HRP的場景:若目標物濃度中等(ng 級及以上),HRP 的靈敏度已足夠(如常規病原體抗體檢測、蛋白定量),且反應快速,操作更便捷。
2. 實驗時間與效率
優先選HRP的場景:HRP催化反應速度快,比色底物(如 TMB)在 15-30 分鐘內即可達到穩定顯色,適合高通量實驗或需要快速出結果的場景(如臨床急診檢測)。
優先選AP的場景:AP反應較慢,但顯色信號持續時間更長(不易褪色),適合對顯色時間靈活性要求高的實驗(如分步操作、多批次檢測),或需要延長反應時間以增強弱信號的場景。
3. 樣本類型與干擾因素
樣本中的內源性物質可能干擾酶的活性,需根據樣本特性選擇:
樣本含內源性過氧化物或還原劑(如血清、組織勻漿中可能存在的過氧化氫酶、維生素 C):這類物質會消耗 HRP 的底物(H?O?)或抑制其活性,導致信號偏低或假陰性,優先選 AP。
樣本含內源性磷酸酶或高濃度磷酸鹽(如尿液、骨骼組織樣本中可能含高活性磷酸酶,或樣本用磷酸鹽緩沖液稀釋):這類物質會干擾 AP 的催化反應(磷酸鹽是 AP 的抑制劑),優先選 HRP。
樣本本身有顏色或濁度(如溶血血清、細胞培養液):HRP 的 TMB 底物顯色為藍色(終止后呈黃色),顏色干擾較小;AP 的 pNPP 底物顯色為黃色,若樣本本身含黃色成分(如黃疸血清),可能疊加干擾,此時優先選 HRP。
4. 底物類型與檢測模式
ELISA 的檢測模式(比色、化學發光、熒光)依賴于酶與底物的匹配,選擇酶需結合底物特性:
比色檢測:
HRP 常用底物為 TMB(藍色→黃色,終止后穩定)、OPD(橙色,易氧化褪色),其中 TMB 穩定性好、靈敏度高,是主流選擇。
AP 常用底物為 pNPP(黃色,穩定性好但靈敏度中等),或 BCIP/NBT(紫色沉淀,適用于膜 ELISA 如 WB,但不適用于微孔板比色)。若需比色檢測且追求穩定性,HRP+TMB 組合更常用。
化學發光檢測:
HRP 常用化學發光底物為魯米諾 / 過氧化氫體系(信號持續時間短,需立即讀數)。
AP 常用化學發光底物為 AMPPD(信號持續數小時至數天,可延遲讀數,靈敏度更高)。若需高靈敏度且允許延遲讀數,優先選 AP+AMPPD;若需快速發光檢測,HRP 更合適。
5. 成本與實驗便利性
成本敏感型實驗:HRP 的酶標記抗體、底物價格更低,且更易商業化獲取(多數 ELISA 試劑盒默認 HRP 標記),適合大規模篩查或常規檢測,優先選 HRP。
操作便利性:HRP 對實驗條件(如溫度、pH)的耐受性更強,不易因輕微操作誤差(如孵育溫度波動)影響活性;AP 需更嚴格控制反應條件(如避免低溫失活),操作容錯率稍低。
6. 特殊實驗需求
化學發光或電化學檢測:若需聯用化學發光儀或電化學檢測平臺,AP 的長效發光底物(如 AMPPD)更適合,信號穩定性優于 HRP 的魯米諾體系。
多重檢測或可視化實驗:AP 的 BCIP/NBT 底物可產生紫色沉淀,適合膜 ELISA(如斑點 ELISA)或原位顯色實驗;HRP 的 TMB 更適合微孔板的定量比色檢測。
三、核心選擇邏輯
優先選 HRP:常規靈敏度需求、樣本無過氧化物干擾、追求快速 / 低成本、樣本無顏色干擾。
優先選 AP:超高靈敏度需求(pg 級)、樣本含過氧化物 / 還原劑、需要長效穩定信號、化學發光檢測。
實際應用中,多數 ELISA 試劑盒已預設標記酶(以 HRP 為主),但若需定制或優化實驗,需結合上述原則,通過預實驗驗證酶與樣本、底物的兼容性,確保檢測準確性。
實際應用中,多數 ELISA 試劑盒已預設標記酶(以 HRP 為主),但若需定制或優化實驗,需結合上述原則,通過預實驗驗證酶與樣本、底物的兼容性,確保檢測準確性。