elisa試劑盒檢測樣本時為何需要做稀釋對照?怎么避免鉤狀效應?
日期:2025-07-22 14:51:18
在ELISA(酶聯免疫吸附試驗)檢測中,稀釋對照和避免鉤狀效應是保證結果準確性的關鍵環節。以下從原理、作用及解決方案兩方面詳細說明:
一、為何需要做稀釋對照?
稀釋對照是指對樣本進行梯度稀釋后檢測,通過比較不同稀釋倍數的結果來驗證檢測有效性。其核心作用包括以下幾點:
1. 驗證樣本濃度是否在試劑盒線性范圍內
ELISA 試劑盒的檢測結果僅在特定線性范圍內可靠(即抗原 / 抗體濃度與信號值呈線性關系)。若樣本中目標物濃度過高,超出試劑盒的線性上限,信號值會偏離線性(可能飽和或下降),直接檢測會導致結果偏低或失真。
稀釋對照通過梯度稀釋(如 1:10、1:100、1:1000),觀察不同稀釋倍數的信號值是否隨稀釋比例呈線性遞減。若結果線性良好,說明稀釋后的樣本濃度在有效范圍內,可通過計算還原實際濃度;若非線性,則提示存在干擾(如鉤狀效應、基質效應)。
2. 檢測鉤狀效應的存在
鉤狀效應(Hook effect)是 ELISA 中常見的干擾現象,尤其在雙抗體夾心法中,當樣本中抗原濃度過高時,過量抗原會與固相抗體和酶標抗體分別結合,但無法形成 “固相抗體 - 抗原 - 酶標抗體” 的夾心復合物(因抗原分子數量遠多于抗體結合位點),導致信號值異常偏低(假陰性)。
稀釋對照可通過觀察 “高濃度樣本信號低,稀釋后信號升高且與稀釋倍數成比例” 的現象,直接判斷是否存在鉤狀效應(見下文詳述)。
3. 排除基質效應的干擾
樣本基質(如血清、血漿、組織勻漿中的蛋白質、脂質等)可能非特異性結合抗體或酶標物,干擾檢測信號(基質效應)。稀釋樣本可降低基質中干擾物質的濃度,減弱其影響。
稀釋對照中,若不同稀釋倍數的結果偏差較大(如未稀釋時信號異常高 / 低,稀釋后恢復正常),提示存在基質效應,需以稀釋后的結果為準。
4. 確保結果的重復性和可靠性
通過梯度稀釋的平行實驗,可觀察結果的一致性(如不同稀釋倍數的計算濃度是否接近),排除操作誤差或樣本不均一性導致的偏差。

二、如何避免鉤狀效應?
鉤狀效應的本質是抗原過量,導致夾心復合物無法有效形成。避免或減少鉤狀效應的核心是控制樣本中抗原濃度在試劑盒的有效檢測范圍內,具體方法如下:
1. 預實驗預估樣本濃度,選擇合適稀釋倍數
若已知樣本可能含高濃度目標物(如臨床樣本中的腫瘤標志物、炎癥因子),先通過文獻或預實驗(如用高稀釋倍數快速篩查)估計濃度范圍,再選擇試劑盒線性范圍內的稀釋倍數(如推薦稀釋 1:1000 時,避免直接用未稀釋樣本檢測)。
對于未知樣本,建議同時設置多個稀釋梯度(如 1:10、1:50、1:100、1:500),確保至少 1-2 個稀釋度落在試劑盒線性范圍內。
2. 選擇寬線性范圍的試劑盒
不同試劑盒的線性范圍差異較大,優先選擇線性范圍寬(如涵蓋 ng/mL 至 μg/mL 級別)的產品,減少因濃度過高超出范圍的概率。同時,注意試劑盒說明書中關于 “高濃度樣本處理” 的建議(如強制稀釋步驟)。
3. 優化檢測步驟,減少抗原過量風險
延長孵育時間或增加抗體濃度:在雙抗體夾心法中,若懷疑抗原過量,可適當延長酶標抗體的孵育時間,或選擇抗體濃度更高的試劑盒,增加夾心復合物形成的概率。
采用分步孵育模式:先加入樣本與固相抗體孵育,洗滌后再加入酶標抗體,避免抗原同時與兩種抗體競爭性結合(傳統一步法更易出現鉤狀效應)。
4. 通過梯度稀釋驗證并校正結果
若檢測中發現疑似鉤狀效應(如高濃度樣本信號低于低稀釋度樣本),需通過以下標準確認:
稀釋后的樣本信號隨稀釋倍數成比例升高(如 1:100 稀釋的信號是 1:10 稀釋的 10 倍);
校正后(實際濃度 = 檢測值 × 稀釋倍數)的結果在不同稀釋度間一致。
符合上述標準則說明存在鉤狀效應,需以線性范圍內的稀釋結果計算實際濃度。
5. 特殊場景下的替代方法
對于已知極高濃度的樣本(如細胞培養上清液),可采用競爭法 ELISA(適用于小分子抗原)或化學發光免疫分析(CLIA)等更寬范圍的檢測技術,減少鉤狀效應風險。
必要時結合其他方法驗證(如 Western blot、質譜),交叉確認結果準確性。
稀釋對照是 ELISA 檢測中不可或缺的質量控制手段,其核心作用是驗證線性范圍、發現鉤狀效應和基質干擾,確保結果可靠。而避免鉤狀效應的關鍵在于通過預實驗合理稀釋樣本、選擇合適試劑盒,并通過梯度稀釋驗證結果線性。這些操作尤其在臨床診斷、生物樣本定量等對準確性要求高的場景中至關重要,可有效減少假陰性或誤判風險。