重組蛋白用于動物實驗或細胞實驗前，需要去除內毒素，常用的內毒素去除方法（如親和層析、超濾）的效果該如何通過鱟試劑法驗證？

日期：2025-09-28 09:31:21

重組蛋白用于動物或細胞實驗前，內毒素殘留需嚴格控制（如細胞實驗通常要求＜0.1EU/μg，動物實驗＜1EU/μg），鱟試劑法是國際公認的內毒素檢測金標準，可精準驗證親和層析、超濾等去內毒素方法的效果。其核心原理是利用鱟（馬蹄蟹）血液提取物中的凝固蛋白原系統與內毒素（脂多糖，LPS）特異性反應，通過觀察“凝固狀態”或“信號強度”定性或定量判斷殘留量，具體驗證流程需結合方法類型和樣品特性展開。

一、鱟試劑法的核心類型（按需選擇）

鱟試劑法主要分為凝膠法和光度法，二者原理一致但檢測精度和適用場景不同，需根據實驗對“內毒素控制精度”選擇：

凝膠法：內毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使凝固蛋白原轉化為凝固蛋白，形成不溶性凝膠。該方法操作簡單、成本低、特異性強，適合定性判斷（內毒素是否超標）或半定量估算（確定大致殘留范圍），常用于去內毒素后的快速初篩。

光度法：內毒素激活反應產生的凝固酶會水解特定底物，釋放發色團或熒光團，通過檢測吸光度或熒光值與標準曲線對比，實現內毒素的精確定量。該方法精度高（檢測限可達0.001EU/mL），能準確量化親和層析、超濾前后的內毒素殘留變化，適合評估去內毒素方法的效率。

二、驗證的核心前提：樣品預處理（消除干擾）

親和層析、超濾后的重組蛋白樣品常含緩沖液成分（如Tris、NaCl、EDTA、咪唑），這些物質可能抑制或激活鱟試劑反應，導致“假陰性”或“假陽性”，因此檢測前必須進行預處理，核心是排除干擾：

稀釋處理：用“無熱原稀釋液”（如無菌無熱原水、0.1%BSA無熱原溶液）將蛋白樣品稀釋至合適濃度——稀釋倍數需結合蛋白濃度（避免高濃度蛋白本身干擾）和內毒素預期殘留量（確保殘留量落在檢測范圍內，如凝膠法通常檢測范圍0.03-10EU/mL），一般稀釋10-100倍。

干擾試驗（必需步驟）：取稀釋后的蛋白樣品，分為兩組：①樣品組（僅稀釋后的蛋白）；②樣品加標組（稀釋后的蛋白+已知濃度的內毒素標準品，如0.5EU/mL）。同時設置“陰性對照”（僅無熱原稀釋液）和“陽性對照”（無熱原稀釋液+同等濃度內毒素標準品）。若樣品加標組的檢測結果與陽性對照的偏差在±50%以內，說明樣品無干擾，可直接檢測；若偏差過大，需進一步稀釋、透析去除干擾物質（如EDTA、高鹽）或更換緩沖液。

三、具體驗證流程（分方法詳解）

1.凝膠法驗證（定性/半定量）

適用于初步判斷“去內毒素后的蛋白是否達標”，無需特殊儀器，操作步驟如下：

試劑準備：取鱟試劑（干粉），按說明書比例用無熱原稀釋液復溶（如1支0.1mL規格的試劑加0.1mL稀釋液），輕輕混勻避免氣泡。

加樣反應：在無熱原試管中加入0.1mL復溶后的鱟試劑，再加入0.1mL預處理后的蛋白樣品（樣品組）、樣品加標組、陰性對照、陽性對照，輕輕混勻后，垂直放入37℃±1℃的恒溫培養箱中，避光靜置60分鐘±2分鐘，期間避免震動。

結果判斷：

定性判斷：培養結束后，輕輕取出試管并倒置180°，若試管內形成“完整、堅韌的凝膠柱”且不脫落，為陽性（含內毒素）；若凝膠未形成或破碎，為陰性（無內毒素或低于檢測限）。

半定量估算：若樣品陽性，可將樣品進一步梯度稀釋（如2倍、4倍、8倍），重復檢測，以“最后呈陽性的最高稀釋倍數”結合稀釋因子計算內毒素含量（如稀釋8倍仍陽性，檢測限0.03EU/mL，則樣品內毒素≥0.03×8=0.24EU/mL）。

驗證結論：若樣品組呈陰性，說明內毒素殘留低于檢測限，去內毒素方法有效；若陽性，需結合半定量結果判斷是否超標，若超標則需優化去內毒素方案。

2.光度法驗證（精確定量）

適用于準確評估親和層析、超濾的去內毒素效率（如計算“去內毒素前后的內毒素去除率”），需配套酶標儀或專用鱟試劑檢測儀，步驟如下：

標準曲線制備：將內毒素標準品用無熱原稀釋液梯度稀釋成一系列濃度（如0.001、0.01、0.1、1、10EU/mL），取各濃度標準品0.1mL，分別與0.1mL復溶的光度法鱟試劑混合，按說明書反應條件（如37℃孵育30分鐘）進行反應，檢測各濃度對應的吸光度或熒光值，以“內毒素濃度為橫坐標，信號值為縱坐標”繪制標準曲線（需保證R²≥0.98）。

樣品檢測：取0.1mL預處理后的蛋白樣品，與0.1mL鱟試劑混合，同標準曲線條件反應并檢測信號值，代入標準曲線計算樣品的內毒素濃度。

結果校正與計算：結合樣品的稀釋倍數，計算“蛋白樣品中內毒素的實際含量”（如稀釋10倍后檢測濃度為0.005EU/mL，則實際含量=0.005×10=0.05EU/mL）；再根據蛋白濃度換算成“EU/μg”（如蛋白濃度1mg/mL=1000μg/mL，則內毒素含量=0.05EU/mL÷1000μg/mL=0.00005EU/μg），與實驗要求的限值對比。

驗證結論：若計算結果低于實驗限值（如細胞實驗＜0.1EU/μg），且去內毒素前后的殘留量差異顯著（如去除前10EU/μg，去除后0.05EU/μg，去除率達99.5%），說明方法有效；若未達標，則需分析去內毒素步驟的缺陷（如親和層析的LPS吸附柱飽和、超濾膜孔徑選擇不當）并優化。

四、關鍵注意事項

全程無熱原操作：所有耗材（試管、移液槍頭、離心管）需為“無熱原級別”，操作在超凈工作臺進行，避免環境中內毒素污染（如手部接觸、空氣揚塵），否則會導致假陽性。

試劑有效性控制：鱟試劑需在2-8℃避光儲存，復溶后立即使用；內毒素標準品需分裝凍存，避免反復凍融導致活性下降。

對照設置不可少：陰性對照用于排除稀釋液、耗材的內毒素污染，陽性對照用于驗證鱟試劑的活性，樣品加標組用于確認樣品無干擾，缺任一對照都會導致結果不可靠。

用鱟試劑法驗證去內毒素效果的核心邏輯是：先通過預處理消除樣品干擾，再根據精度需求選擇凝膠法（初篩）或光度法（定量），結合對照和標準曲線判斷殘留量，最終確認親和層析、超濾等方法是否達到實驗要求的內毒素控制標準。