蛋白表達純化過程中，會通過哪些指標評估蛋白質量（如純度、活性、分子量、穩定性等），檢測方法分別是什么？
日期：2025-09-18 16:09:14
在蛋白表達純化過程中，蛋白質量的評估是確保其后續應用（如結構解析、功能研究、藥物開發、診斷試劑制備等）可靠性的核心環節。評估指標需覆蓋純度、活性、分子量、穩定性、完整性、濃度、均一性等多個維度，不同指標對應多種成熟的檢測方法。以下是詳細分類及說明：
2. 活性（Activity）：衡量蛋白生物學功能的完整性
3. 分子量（Molecular Weight, MW）：驗證目標蛋白的正確性（避免降解 / 聚集）
4. 穩定性（Stability）：衡量蛋白在儲存 / 實驗條件下的保持能力
5. 其他關鍵指標
二、指標選擇策略：根據蛋白應用場景側重
一、核心評估指標及對應檢測方法
1. 純度（Purity）：衡量目標蛋白中雜蛋白的含量
純度是蛋白質量的基礎指標，直接影響后續實驗的準確性（如避免雜蛋白干擾活性檢測）。
| 檢測方法 | 原理 | 優勢 | 局限性/適用場景 |
| SDSPAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳） | 蛋白在變性條件下（SDS+巰基乙醇）按分子量分離，通過考馬斯亮藍/銀染顯色，目標蛋白條帶占總條帶的比例即為純度（半定量）。 | 操作簡單、成本低、直觀 可同時初步判斷分子量 |
半定量（誤差±10%） 無法區分分子量相近的雜蛋白 |
| HPLC（高效液相色譜）反相/離子交換 | 基于蛋白疏水性（反相）或電荷（離子交換）差異，通過色譜柱分離，主峰面積占比即為純度（定量）。 | 高分辨率、準確定量（誤差±2%） 可檢測微量雜蛋白（<0.1%） |
成本較高 反相HPLC需有機相，可能影響蛋白活性 |
| 考馬斯亮藍染色法（Bradford法）結合超濾 | 先通過超濾分離目標蛋白與小分子雜質，再用Bradford法測定總蛋白與目標蛋白濃度，計算純度。 | 適用于去除小分子雜質后的純度評估 | 無法區分大分子雜蛋白（如其他球蛋白） |
| WesternBlot（免疫印跡） | 用特異性抗體檢測目標蛋白，通過條帶有無/強度判斷雜蛋白是否存在（定性/半定量）。 | 極高特異性（僅識別目標蛋白） | 半定量 無法檢測抗體不識別的雜蛋白 |
2. 活性（Activity）：衡量蛋白生物學功能的完整性
活性是功能性蛋白（如酶、抗體、受體）的核心指標，需根據蛋白類型選擇針對性方法。
| 蛋白類型 | 檢測方法 | 原理 | 示例 |
| 酶類蛋白 | 底物顯色法/熒光法 | 利用酶對特異性底物的催化作用，通過吸光度/熒光強度變化計算酶活（單位：U/mg）。 | 蛋白酶：檢測酪蛋白降解后釋放的氨基酸（福林酚法） 激酶：檢測ATP磷酸基團轉移到底物的量（放射性同位素法） |
| 抗體類蛋白 | ELISA（酶聯免疫吸附法） | 用抗原包被板，加入抗體后通過酶標二抗顯色，計算抗體結合活性（EC50值）。 | 單克隆抗體：檢測與腫瘤抗原（如Her2）的結合能力 |
| 受體類蛋白 | 配體結合實驗（BLI/SPR） | 用生物層干涉技術（BLI）或表面等離子體共振（SPR），實時監測受體與配體的結合動力學（親和力KD值）。 | G蛋白偶聯受體（GPCR）：檢測與小分子配體的結合速率與解離速率 |
| 結構蛋白（如膜蛋白） | 功能性整合實驗 | 檢測蛋白是否能正確組裝到膜上并維持結構功能（如離子通道的電生理活性）。 | 離子通道蛋白：通過膜片鉗技術檢測離子通透性 |
3. 分子量（Molecular Weight, MW）：驗證目標蛋白的正確性（避免降解 / 聚集）
| 檢測方法 | 原理 | 優勢 | 局限性 |
| SDSPAGE（還原/非還原條件） | 還原條件（加巰基乙醇）：斷裂二硫鍵，檢測單體分子量； 非還原條件：保持蛋白天然聚合狀態，檢測寡聚體分子量。 |
快速、直觀、成本低 | 誤差較大（±5%10%），需結合蛋白Marker對比 |
| 質譜（MALDITOF/ESIMS） | 蛋白離子化后，根據質荷比（m/z）計算精確分子量。 | 極高精度（誤差<0.1%） 可同時檢測翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化） |
成本高 無法檢測大分子量聚合體（>200kDa，ESIMS除外） |
| 凝膠過濾色譜（GFC/SEC） | 蛋白按Stokes半徑（與分子量正相關）通過凝膠柱，與標準分子量蛋白對比，計算表觀分子量。 | 可同時分析蛋白聚集狀態（如單體/二聚體） | 表觀分子量受蛋白形狀影響（如纖維蛋白與球形蛋白結果差異大） |
4. 穩定性（Stability）：衡量蛋白在儲存 / 實驗條件下的保持能力
穩定性決定蛋白的儲存周期和應用場景（如是否適合長期冷凍、室溫操作）。
| 檢測維度 | 檢測方法 | 原理 | 評估指標 |
| 熱穩定性 | 差示掃描量熱法（DSC） | 監測蛋白隨溫度升高的熱變性過程，記錄變性溫度（Tm值）。 | Tm值越高，熱穩定性越強（如抗體Tm>65℃為合格） |
| 儲存穩定性 | 加速穩定性試驗 | 在不同條件（4℃/25℃/37℃、pH5.08.0、高鹽/低鹽）下儲存，定期檢測純度、活性、聚集率。 | 4℃儲存3個月，活性保留率>90%為合格 |
| 聚集穩定性 | 動態光散射（DLS） | 檢測蛋白顆粒的hydrodynamicradius，計算聚集率（多分散指數PDI）。 | PDI<0.2為單分散（無聚集），PDI>0.5為嚴重聚集 |
| 化學穩定性 | 圓二色譜（CD） | 檢測蛋白二級結構（α螺旋、β折疊）的變化，反映化學變性劑（如尿素、胍鹽）對結構的影響。 | 二級結構含量變化<10%為穩定 |
5. 其他關鍵指標
| 指標 | 檢測目的 | 常用方法 |
| 完整性（Integrity） | 驗證蛋白是否存在降解、斷裂或錯誤剪切 | WesternBlot（檢測是否有降解片段） 質譜（分析序列覆蓋度，需100%覆蓋目標序列） N/C端測序（確認兩端氨基酸是否正確） |
| 濃度（Concentration） | 定量蛋白量，用于后續實驗（如活性檢測、結晶） | BCA法（適用于所有蛋白，抗干擾能力強） Bradford法（適用于球形蛋白，受去污劑干擾） UV280法（利用色氨酸/酪氨酸的紫外吸收，快速但受核酸干擾） |
| 均一性（Homogeneity） | 驗證蛋白是否為單一構象/聚合狀態 | 凝膠過濾色譜（GFC）：單一主峰為均一 動態光散射（DLS）：PDI<0.2 分析型超速離心（AUC）：單一沉降峰 |
| 翻譯后修飾（PTM） | 檢測糖基化、磷酸化等修飾（影響活性/穩定性） | 質譜（MALDITOF/ESIMS，精準鑒定修飾位點） 糖電泳（檢測糖基化水平） 磷酸酶處理結合SDSPAGE（驗證磷酸化） |
二、指標選擇策略：根據蛋白應用場景側重
不同研究目標對蛋白質量的要求差異較大，需針對性選擇核心指標：
結構解析（如 X 射線晶體學）：優先關注 純度（>95%）、均一性（PDI<0.15）、完整性（無降解），活性可次要（部分結構研究需蛋白保持天然構象）。
功能研究（如酶動力學、信號通路）：核心是 活性（需準確定量），同時要求純度 > 90%（避免雜蛋白干擾）、穩定性（確保實驗重復性）。
藥物開發（如抗體藥）：需全面評估，包括 純度（>99%）、活性（KD 值 / EC50 值）、穩定性（Tm>60℃，4℃儲存 6 個月活性保留 > 85%）、低聚集率（<1%），且需符合 GMP 級檢測標準。
診斷試劑（如抗原檢測試劑盒）：側重 特異性（Western Blot 驗證無交叉反應）、穩定性（室溫儲存 12 個月活性不變）、均一性（批間差異 < 5%）。
蛋白質量評估需形成 “多指標組合” 體系，而非單一方法判定。例如：
對于重組酶蛋白，需通過 SDS-PAGE（初篩純度）+ HPLC（精確定量純度）+ 底物顯色法（活性）+ DLS（聚集率）+ DSC（熱穩定性） 全面驗證；
對于單克隆抗體，需通過 HPLC（純度 > 99%）+ ELISA（結合活性）+ GFC（聚集率 < 1%）+ 加速穩定性試驗（4℃儲存 6 個月）+ 質譜（糖基化修飾） 評估。
最終需根據蛋白的 “應用目標” 和 “特性”（如分子量、是否含二硫鍵、是否易聚集），靈活選擇最適合的檢測方法組合。
