熒光素標(biāo)記的流式抗體在使用過程中，如何避免光漂白現(xiàn)象影響信號強(qiáng)度？操作時需采取哪些避光措施？
日期：2025-09-16 17:05:43
一、先明確：不同熒光素的光漂白敏感性差異（規(guī)避的基礎(chǔ)）
不同熒光素對光的耐受度不同，選擇時需優(yōu)先關(guān)注其光穩(wěn)定性，從源頭降低漂白風(fēng)險。常見流式熒光素的光穩(wěn)定性排序（由高到低）如下：
APC/Cy7 > PE/Cy7 > APC > PE > PerCP-Cy5.5 > FITC > Alexa Fluor 488 > Pacific Blue
例如：FITC（異硫氰酸熒光素）對可見光（尤其藍(lán)光）極敏感，10分鐘室溫暴露即可出現(xiàn)明顯漂白；而APC（別藻藍(lán)蛋白）為藻膽蛋白類，光穩(wěn)定性顯著優(yōu)于小分子有機(jī)熒光素。
核心邏輯：光穩(wěn)定性差的熒光素（如FITC）需更嚴(yán)格的避光措施，光穩(wěn)定性強(qiáng)的（如 APC）可適當(dāng)放寬，但仍需基礎(chǔ)避光。
二、全流程避光操作：從 “抗體準(zhǔn)備” 到 “上機(jī)檢測” 的關(guān)鍵措施
光漂白的影響貫穿 “抗體孵育→樣本洗滌→上機(jī)前等待→流式檢測” 全流程，需針對每個環(huán)節(jié)設(shè)計避光方案：
1. 抗體儲存與稀釋階段：阻斷 “預(yù)漂白”
儲存避光：熒光標(biāo)記抗體出廠時通常為棕色管或鋁箔包裹，需嚴(yán)格按說明書（如 4℃避光或-20℃分裝冷凍）儲存，避免反復(fù)凍融（凍融會破壞抗體結(jié)構(gòu)，間接降低熒光信號）。
稀釋避光：稀釋抗體時，需在避光環(huán)境（如超凈臺內(nèi)關(guān)閉紫外燈、拉上遮光簾，或使用避光離心管）中操作，稀釋后立即使用，避免室溫敞口放置（尤其避免陽光、日光燈直射）。
2. 抗體孵育階段：核心避光環(huán)節(jié)
孵育是細(xì)胞與抗體結(jié)合的關(guān)鍵步驟，若暴露于光下，未結(jié)合的游離熒光素和已結(jié)合的抗體均會發(fā)生漂白，直接導(dǎo)致陽性信號減弱。
環(huán)境避光：將孵育管/板置于避光盒、錫箔紙包裹的容器或暗室中，避免實(shí)驗室日光燈、顯微鏡光源、陽光照射。
溫度與時間控制：多數(shù)流式抗體孵育條件為 “4℃避光30分鐘～1小時”（4℃可降低分子運(yùn)動速率，減少非特異性結(jié)合，同時減緩光化學(xué)反應(yīng)速率）；若需室溫孵育，需縮短至15~20分鐘，并全程嚴(yán)格避光。
避免開蓋觀察：孵育過程中不要頻繁打開避光容器查看，減少光暴露次數(shù)。
3. 樣本洗滌與離心階段：減少殘留熒光素的漂白
洗滌的目的是去除未結(jié)合的游離熒光素（這類熒光素若殘留，會增加背景信號，且其漂白產(chǎn)物可能干擾檢測），此階段需注意：
離心環(huán)境：離心時將離心機(jī)置于避光處（如實(shí)驗室角落，遠(yuǎn)離光源），或用錫箔紙包裹離心轉(zhuǎn)子（避免離心過程中樣本受環(huán)境光照射）。
洗滌液避光：洗滌用的PBS或流式緩沖液（含BSA、EDTA）需避光儲存，使用時現(xiàn)取現(xiàn)用，避免長時間敞口暴露。
快速操作：洗滌時盡量縮短樣本在空氣中的暴露時間，離心后迅速棄上清、加入緩沖液重懸，全程在避光環(huán)境下進(jìn)行。
4. 上機(jī)前等待與檢測階段：避免 “最后一步” 漂白
上機(jī)前儲存：樣本制備完成后，若無法立即上機(jī)，需將樣本置于4℃避光環(huán)境中，且等待時間不超過 1 小時（長時間儲存不僅可能導(dǎo)致光漂白，還可能因細(xì)胞沉降、死亡影響散射光信號）。
流式儀操作：
開機(jī)后先校準(zhǔn)儀器（確保激光強(qiáng)度、檢測器靈敏度穩(wěn)定），再加載樣本，減少樣本在激光下的預(yù)暴露時間；
樣本加載后立即開始檢測，避免樣本在進(jìn)樣器中長時間靜置（部分流式儀進(jìn)樣器有避光設(shè)計，但仍需快速檢測）；
檢測完成后，及時卸載剩余樣本，避免樣本繼續(xù)受激光或環(huán)境光照射。
三、額外優(yōu)化策略：進(jìn)一步降低光漂白影響
除了操作層面的避光，還可通過以下方法增強(qiáng)熒光信號穩(wěn)定性：
使用抗光漂白劑：若需長時間孵育或樣本制備后需延遲檢測，可在流式緩沖液中加入專用的抗光漂白劑（如含抗氧化劑、自由基清除劑的試劑，需選擇與流式檢測兼容的產(chǎn)品，避免影響細(xì)胞活性或抗體結(jié)合）。
選擇高穩(wěn)定性熒光素衍生物：例如，Alexa Fluor系列（如Alexa Fluor 488、647）的光穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)FITC、PE，可優(yōu)先選擇（需注意與流式儀激光波長匹配，如Alexa Fluor 488需藍(lán)光激發(fā)，Alexa Fluor 647需紅光激發(fā)）。
優(yōu)化抗體濃度：抗體濃度過高會導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，過低則信號弱，需通過預(yù)實(shí)驗確定最佳濃度（最佳濃度下，陽性信號最強(qiáng)、背景最低，可減少因信號過弱導(dǎo)致的 “漂白后無信號” 問題）。
避光操作的核心原則
光漂白的影響與 “光強(qiáng)度×暴露時間” 正相關(guān)，因此所有措施的核心邏輯是：在不影響抗體結(jié)合效率和細(xì)胞活性的前提下，最大限度降低光強(qiáng)度（選擇避光環(huán)境）、縮短暴露時間（優(yōu)化操作流程） 。
對于光穩(wěn)定性差的熒光素（如FITC、Pacific Blue），需執(zhí)行 “全流程嚴(yán)格避光”；對于光穩(wěn)定性強(qiáng)的熒光素（如 APC、PE/Cy7），雖可適當(dāng)放寬，但基礎(chǔ)的 “孵育避光、上機(jī)前避光” 仍需遵守，才能確保流式數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。
