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羥脯氨酸含量測定實驗原理

日期:2023-06-01 15:11:34


    羥脯氨酸(Hydroxyproline)是膠原蛋白的特異性氨基酸,是其分子中順序排列的重要基元。羥脯氨酸含量是膠原蛋白含量的指標之一,因此測定羥脯氨酸含量可以用于評價動物和人體的膠原質(zhì)量。以下是測定羥脯氨酸含量的實驗原理。

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一、試劑及設備準備

    1、0.1 mol/L HCl:取一定量的濃鹽酸(36%~38%)加入定容瓶中,加入去離子水至1000 mL,搖勻。通常使用10倍稀釋液。
 
    2、次氯酸鈉溶液:在無菌條件下將25%的次氯酸鈉稀釋到合適的濃度并保存于冰箱中。
 
    3、酚紅標準溶液:稱取100mg酚紅粉末,加入蒸餾水1000mL搖勻,過濾。用0.01mol/L NaOH調(diào)整pH值為8.0,然后使用氧化鐵標準溶液進行校準。
 
    4、羥脯氨酸標準品:取得羥脯氨酸標準品,稱取一定量的羥脯氨酸標準品,加入去離子水中稀釋得到不同濃度的羥脯氨酸標準品。
 
    5、蛋白質(zhì)提取液:取得需要檢測的樣品(如皮膚、骨、肌肉等組織),按照以下步驟進行樣品處理。

    (1)將樣品均勻地切成小碎塊,加入甲醇溶液淬火.
    (2)將淬火后的樣品放入離心管中,離心收集上清液。
    (3)將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中,加入10倍體積的無菌水,并在80°C下加熱至樣品溶解。
    (4)將樣品冷卻至常溫并離心去掉沉淀,將上清液過濾或離心去掉異常懸浮物即為蛋白質(zhì)提取液。
 
    離心管、比色皿、分液漏斗、濾紙等常用實驗儀器。
 
二、實驗操作步驟
 
    1、樣品預處理
    取一定量的組織樣品,按照上述處理步驟制備出蛋白質(zhì)提取液。
 
    2、水解
    取100μL蛋白質(zhì)提取液,加入10μL1 mol/L NaOH和5μL 6 mol/L HCl,加水至100μL并混勻。放入80℃水浴中水解12~24小時。
 
    3、水解液處理
    將水解液離心收集上清液。取樣品1000 μL,加入50μL 10%次氯酸鈉和50μL0.1mol/L HCl,靜置30min。加入5%酚紅標準溶液2mL,并使用0.1mol/L HCl滴定至顏色變?yōu)辄S色至粉紅色轉(zhuǎn)化點為止。
 
    4、羥脯氨酸含量的計算
    根據(jù)標準曲線所得的羥脯氨酸質(zhì)量,除以水解液中所用的蛋白質(zhì)量,即可得到羥脯氨酸含量。
 
三、結果分析
 
    根據(jù)結果進行羥脯氨酸含量計算和統(tǒng)計分析,可以計算出不同樣品的羥脯氨酸含量,并可以對不同樣品間的差異進行比較和分析。這些計算和分析結果可以反映出樣品膠原蛋白的品質(zhì)及其與肌肉和其他組織等相比的相對含量。需要注意的是,進行分析之前要確保所使用的標準品和試劑的質(zhì)量已得到驗證,并且實驗過程中要避免污染或誤操作的影響。
 
    測定羥脯氨酸含量是通過酸性氫氧化水解樣品,再使用比色法測定水解液中的羥脯氨酸含量,以此評價樣品中膠原質(zhì)量的指標。


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