酵母雙雜交篩選互作蛋白流程
日期：2023-05-29 16:31:20
酵母雙雜交技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)互作篩選方法，通過利用酵母中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域（BD）和激活域（AD）相互作用來檢測目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)是否存在互作關(guān)系。這項技術(shù)可以用于從大量的蛋白質(zhì)庫中篩選出與已知蛋白質(zhì)相互作用的候選分子。下面將介紹酵母雙雜交篩選互作蛋白的流程。
一、克隆兩個DNA片段
首先需克隆兩個DNA片段：一個用于編碼轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域BD，另一個用于編碼激活域AD。這兩個DNA片段需分別克隆到不同的表達(dá)載體中。其中，BD和AD的序列應(yīng)該很短，這有助于減少錯配結(jié)合和非特異性激活的可能性。此外，在選擇BD和AD的序列時要避免它們之間的重疊區(qū)。BD和AD序列應(yīng)該還需要經(jīng)過驗證，以確保它們不對細(xì)胞造成毒性影響。
二、將兩個表達(dá)載體引入酵母細(xì)胞
將BD載體和AD載體分別轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，然后進(jìn)行培養(yǎng)。要確保轉(zhuǎn)化效率、酵母細(xì)胞健康狀態(tài)和表達(dá)載體的穩(wěn)定性。
三、篩選蛋白質(zhì)相互作用
將需要篩選的蛋白質(zhì)庫與轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂在含有選擇素的富含糖的平板上。這些平板上的細(xì)胞將生長出許多小白色斑點，這些斑點代表可能存在蛋白質(zhì)互作的情況。待這些小斑點變大之后，將它們收集到小管中，并進(jìn)行PCR擴增，以確定它們的DNA序列?？稍讷@得的DNA序列數(shù)據(jù)庫中搜索匹配的蛋白資料庫，查看其是否已知與目標(biāo)蛋白有互作關(guān)系。
此外，在酵母雙雜交中還需注意以下事項：
1、轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞應(yīng)該是健康狀態(tài)的，并且表達(dá)載體應(yīng)該是穩(wěn)定的。
2、選擇合適的蛋白質(zhì)庫，以確保它包含感興趣的蛋白質(zhì)。通常，可以采用人類或其它模式生物的基因庫。
3、在初始篩選時，應(yīng)該使用嚴(yán)格的選擇條件，以排除非特異性的互作。
4、在一些情況下，可以采用一些輔助技術(shù)，如藍(lán)/白斑點法和X-gal染色法，以提高篩選的靈敏度和特異性。
酵母雙雜交技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)互作篩選方法，可以從大量的蛋白質(zhì)庫中篩選出與已知蛋白質(zhì)相互作用的候選分子。在進(jìn)行這項技術(shù)時，需要注意一些注意事項，并嚴(yán)格按照實驗流程進(jìn)行操作。
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