大腸桿菌抗原抗體分離結(jié)合純化效價(jià)測(cè)定

日期：2023-05-16 13:11:44

大腸桿菌可以引起各種疾病的腸道細(xì)菌。為了研究大腸桿菌感染機(jī)理，需要對(duì)其抗原和抗體進(jìn)行分離、結(jié)合和測(cè)定。本文將介紹大腸桿菌抗原抗體分離結(jié)合純化效價(jià)測(cè)定的相關(guān)技術(shù)和方法。

一、大腸桿菌抗原制備

制備大腸桿菌抗原通常有兩種方法：

培養(yǎng)和收集大腸桿菌

首先需要培養(yǎng)大腸桿菌。將大腸桿菌接種到含有適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，通過(guò)搖床或震蕩培養(yǎng)。然后，將培養(yǎng)出的細(xì)胞收集下來(lái)，通過(guò)離心、洗滌等步驟得到細(xì)胞沉淀作為抗原。

表達(dá)大腸桿菌蛋白

另一種方法是利用重組DNA技術(shù)，將大腸桿菌蛋白質(zhì)基因克隆到表達(dá)載體中，并在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)完成后，將大腸桿菌收集下來(lái)，將其破裂并收集蛋白質(zhì)以作為抗原。

二、大腸桿菌抗體制備

制備大腸桿菌抗體的方法通常有以下幾種：

培養(yǎng)細(xì)胞得到多克隆抗體

將抗原注射到動(dòng)物體內(nèi)，讓其產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。然后收集動(dòng)物的血清，并通過(guò)不同的方法制備出多克隆抗體。例如，可以采用親和層析純化法、SDS-PAGE電泳法等。

重組抗體技術(shù)

除了動(dòng)物血清制備多克隆抗體外，也可以利用重組DNA技術(shù)制備單克隆抗體。通過(guò)基因克隆和表達(dá)技術(shù)，得到重組的單克隆抗體。這類(lèi)抗體具有高特異性和高親和力，適用于各種免疫學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

三、抗原-抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)

抗原-抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)通常使用ELISA法進(jìn)行測(cè)定。以下是步驟：

涂覆抗原

將抗原溶液加入微孔板中，放置在4℃下過(guò)夜，使其牢固地附著在板上。

遮蔽無(wú)特異性結(jié)合

將微孔板里的抗原溶液棄去，再加入蛋白質(zhì)（如牛血清蛋白）等有機(jī)物，防止與特異性抗體結(jié)合。

加入稀釋后的抗體

將稀釋后的抗體加入到孔中，與抗原作用。對(duì)于多克隆抗體，可以選擇一定稀釋度；對(duì)于單克隆抗體，通常使用較高的稀釋度。

加入次級(jí)抗體標(biāo)記

添加次級(jí)抗體（如HRP標(biāo)記的抗鼠IgG抗體或抗兔IgG抗體），與抗體作用，用以標(biāo)志檢測(cè)到的特異性抗體。

加入底物

加入色素底物，觀察顏色變化。

讀取結(jié)果

利用酶標(biāo)儀等設(shè)備讀取樣品吸光度數(shù)據(jù)，計(jì)算出抗原-抗體結(jié)合效價(jià)值。

四、純化方法

分離和純化大腸桿菌抗原和抗體通常采用以下幾種方法：

凝膠過(guò)濾層析法

這是一種基于分子量差異的分離方法。將待分離的混合物加入到凝膠柱中，大分子會(huì)被凝膠過(guò)濾，小分子則能夠滲透進(jìn)入凝膠孔中，從而實(shí)現(xiàn)分離。

陰離子交換層析法

這是一種基于電荷差異的分離方法。將待分離的混合物加入到陰離子交換柱中，大分子具有更多的負(fù)電性，會(huì)與陰離子交換樹(shù)脂發(fā)生靜電作用，從而被分離。

親和層析法

這是一種基于特異性結(jié)合的分離方法。在親和層析柱中填充配體（如親和素或抗體），然后將待分離的混合物通過(guò)柱子，特異性結(jié)合的物質(zhì)可以被捕獲并從柱子上洗脫出來(lái)。

逆向相色譜法

這是一種基于極性差異的分離方法。逆相色譜柱內(nèi)充滿了疏水性樹(shù)脂，樣品中的組分在柱子中因極性不同而分散。此時(shí)，小分子化合物能夠滲透到樹(shù)脂孔徑中，而大分子組分則難以滲透，從而實(shí)現(xiàn)分離。

五、效價(jià)測(cè)定

抗原-抗體結(jié)合效價(jià)測(cè)定是一種常見(jiàn)的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，用于評(píng)估抗體對(duì)待檢物質(zhì)的特異性識(shí)別能力。具體步驟包括：

確定抗原標(biāo)準(zhǔn)品

選擇合適的抗原，并制備出不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品作為參考。

確定抗體稀釋度

選擇合適的抗體，并制備出一系列不同稀釋度的抗體溶液。

建立ELISA系統(tǒng)

將抗原溶液加入微孔板中，加入上述稀釋后的抗體溶液進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，最終使得酶反應(yīng)產(chǎn)生的顏色可以被觀察到。

讀取數(shù)據(jù)

使用酶標(biāo)儀讀取陽(yáng)性和陰性對(duì)照以及標(biāo)準(zhǔn)抗原之間的差異。

計(jì)算效價(jià)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的效價(jià)值。

大腸桿菌抗原和抗體的分離、結(jié)合和測(cè)定是研究大腸桿菌感染機(jī)理和疫苗研制的重要手段。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況選擇合適的技術(shù)和方法，以獲得準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。