大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體的原理

日期：2023-05-15 17:08:57

大腸桿菌是重組蛋白表達(dá)的常見(jiàn)細(xì)菌載體之一。重組蛋白表達(dá)載體是將目的基因或外源蛋白表達(dá)序列插入到載體中后，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的工具。本文將詳細(xì)介紹大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體的原理。

選擇適當(dāng)?shù)闹亟M蛋白表達(dá)載體

在大腸桿菌中，常用的重組蛋白表達(dá)載體主要有pET、pGEX等，以及其變種。這些載體有不同的優(yōu)點(diǎn)和適用范圍。例如，pET系列載體在特定缺陷突變的大腸桿菌菌株BL21(DE3)中，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的過(guò)量表達(dá)，適合于表達(dá)難以穩(wěn)定折疊的蛋白質(zhì)；pGEX載體則帶有GST標(biāo)簽，能夠在表達(dá)之后方便地進(jìn)行純化，適合于表達(dá)小分子親和試劑或結(jié)構(gòu)域等等。

插入目的基因或外源蛋白表達(dá)序列

重組蛋白表達(dá)載體都是線性脫敏的，具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，方便將目的基因或外源蛋白表達(dá)序列插入其中。首先，需要根據(jù)目的基因或蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出該序列并使用限制性酶切割。然后，將產(chǎn)生的片段與載體進(jìn)行連接，最終得到重組載體。這個(gè)過(guò)程可以通過(guò)PCR、酶切和連接等常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。

轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

重組載體構(gòu)建完成后，需要將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。轉(zhuǎn)化的概念是指將外源DNA或RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，使其成為細(xì)胞的一部分。在基因克隆和基因工程中，轉(zhuǎn)化技術(shù)是一個(gè)非常重要的基礎(chǔ)技術(shù)。一般來(lái)說(shuō)，載體DNA會(huì)通過(guò)電穿孔或熱激等方法導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)，然后在培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。

轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件的調(diào)節(jié)，會(huì)開(kāi)始表達(dá)目的蛋白質(zhì)。一般來(lái)說(shuō)，重組載體會(huì)帶有啟動(dòng)子、調(diào)控元件和終止子等重要的基因元件，可以控制蛋白質(zhì)表達(dá)的水平和可能的產(chǎn)物形式。常用的誘導(dǎo)條件包括用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）等物質(zhì)刺激。此外，可以使用特定缺陷突變的大腸桿菌菌株，來(lái)實(shí)現(xiàn)高效的過(guò)量表達(dá)。

蛋白純化

表達(dá)后的蛋白質(zhì)需要進(jìn)行純化。重組載體的優(yōu)點(diǎn)之一是它們經(jīng)常帶有特定表達(dá)標(biāo)簽或序列，如6xHis標(biāo)簽、GST標(biāo)簽等，方便后續(xù)的蛋白質(zhì)純化。例如，在pET系統(tǒng)中，常用親和層析技術(shù)（如鎳柱親和層析）實(shí)現(xiàn)純化。而在pGEX系統(tǒng)中，則采用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽的特性，選擇谷胱甘肽親和層析進(jìn)行純化。

大腸桿菌重組蛋白表達(dá)載體的原理是將目的蛋白質(zhì)表達(dá)序列插入到載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和純化。這個(gè)技術(shù)對(duì)于生命科學(xué)領(lǐng)域和工業(yè)生產(chǎn)中的蛋白質(zhì)研究都具有重要的應(yīng)用前景。