單克隆抗體實驗公司的步驟有哪些？

日期：2025-01-03 13:30:44

單克隆抗體實驗主要包括以下幾個關鍵步驟：

1、免疫動物
選擇動物：一般選用 6-8 周齡雌性 Balb/c 小鼠，因為其遺傳背景清晰，免疫反應較為穩定，且與常用的骨髓瘤細胞系在組織相容性上匹配較好，有利于后續的細胞融合和雜交瘤細胞的生長。

免疫方案制定：根據抗原的特性選擇合適的免疫方案。對于可溶性抗原免疫原性弱的情況，通常要加佐劑，如福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。初次免疫時，一般每只小鼠注射 50μg 抗原加福氏完全佐劑，皮下多點注射，間隔 3 周左右；第二次免疫，劑量和途徑同上，但使用福氏不完全佐劑；第三次免疫，劑量不變，不加佐劑，腹腔注射，7 天后采血測其效價；加強免疫，劑量 50μg，腹腔注射，3 天后取脾融合。

2、細胞融合

準備細胞：

骨髓瘤細胞：在融合前 48-36 小時，將骨髓瘤細胞擴大培養。融合當天，收集細胞，離心洗滌后重懸，進行活細胞計數備用。常用的骨髓瘤細胞系有 SP2/0 等。

脾細胞：取已經免疫的 Balb/c 小鼠，通過頸脫位致死，浸泡于 75% 酒精中消毒后，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液，計數備用。

融合操作：將骨髓瘤細胞與脾細胞按一定比例混合，通常為 1:5-1:10，加入促融合劑聚乙二醇（PEG）。在 PEG 作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

3、選擇性培養

培養基選擇：一般采用 HAT 選擇性培養基。在 HAT 培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成 DNA 而死亡；未融合的淋巴細胞雖具有該酶，但本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉移酶，并具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在 HAT 培養基中存活和增殖。

培養條件：將融合后的細胞懸液分裝到 96 孔細胞培養板中，每孔 100μl，然后將培養板置 37℃，5% CO?培養箱內培養。6 小時后補加選擇培養基，每孔 50μl，3 天后用選擇培養基半換液，經常觀察雜交瘤細胞生長情況。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

篩選方法：通常采用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。采用靈敏、快速、特異的免疫學方法，如酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞。

克隆化培養：將篩選出的陽性雜交瘤細胞進行克隆擴增，可采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法等。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時進行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備

體內誘生法：取 Balb/c 小鼠，首先腹腔注射 0.5ml 液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2 周后，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，并產生和分泌單克隆抗體。約 1-2 周后，可見小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

體外培養法：將雜交瘤細胞置于培養瓶或生物反應器中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生并分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量相對有限。

6、單克隆抗體的鑒定

抗體特異性鑒定：采用 ELISA、免疫印跡、免疫組化等方法，檢測單克隆抗體與目標抗原的特異性結合能力，確保其只與目的抗原反應，而不與其他無關抗原交叉反應。

抗體親和力鑒定：通過表面等離子共振、生物膜層干涉技術等方法，測定單克隆抗體與抗原的親和力常數，評估其結合的緊密程度和穩定性。

抗體效價測定：采用 ELISA 等方法，測定單克隆抗體的效價，即抗體的濃度或活性水平，以確定其在實驗或應用中的有效性和適用性。

抗體亞型鑒定：采用 ELISA、免疫印跡等方法，確定單克隆抗體的免疫球蛋白類型和亞類，如 IgG、IgM、IgA 等及其亞型，了解其結構和功能特性。