小分子化合物的抗體制備研究概況

日期：2023-03-27 11:02:50

小分子化合物指的是農藥、獸藥、生物毒素、環境污染物、激素、重金屬等分子量不超過5000的物質。小分子化合物的痕量微量檢測在農業、食品安全、環境監測、醫學診斷等領域均具有重要的意義。基于抗原－抗體特異性識別的免疫分析技術具有特異性強、靈敏度高、穩定性好、操作簡便快捷等優點。目前檢測小分子化合物的免疫分析技術主要包括酶聯免疫吸附分析、膠體金試紙條、量子點熒光免疫分析、化學發光免疫分析、熒光偏振免疫分析、時間分辨熒光免疫分析、生物傳感器以及芯片技術等。

抗體可以分為傳統抗體和新型抗體。傳統抗體指的是傳統的多克隆抗體和單克隆抗體，新型抗體指的是一些具有抗體功能的、可與小分子化合物發生特異性結合的生物分子，主要包括基因重組抗體、核酸來源抗體、抗轉運蛋白、分子印跡聚合物以及受體等。

小分子化合物抗體制備的關鍵是半抗原設計，由于小分子化合物分子量相對較小，僅有反應原性而無免疫原性，因此必須將小分子半抗原與大分子載體蛋白偶聯，才能通過各種抗體技術制備針對半抗原的特異性抗體。小分子化合物抗體制備過程篩選檢測方法與大分子不同，為間接競爭酶聯免疫分析方法，需要考慮到設計包被原同免疫原的載體蛋白不同，另外待識別小分子的純度、溶解度及其結構類似物也要提前考慮。

一、傳統抗體

常見的傳統抗體主要為兔多克隆抗體和小鼠雜交瘤單克隆抗體。傳統抗體經過多年發展，為免疫分析技術做出巨大貢獻，依然是目前小分子化合物免疫分析的核心原料。兔多克隆抗體制備來源多及制備方法簡單，在早期應用較多，但特異性不高且批次差異大制約了免疫分析方法的特異性及重復性。小鼠單克隆抗體具有特異性強、效價高、易于批量生產等優點，目前在小分子化合物比如農獸藥殘留、藥物開發、環境保護等領域得到了廣泛應用。基于雜交瘤技術的單克隆抗體制備大致流程包括完全抗原的設計與合成、免疫動物、細胞融合、檢測及選擇性培養、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化等步驟，由于整個過程所涉及的材料以及操作技術均較多，因此每一步都可能影響最終抗體的產量與質量。

二、基因重組抗體

隨著基因工程技術的進步，基因重組抗體的研究也有很大進展，迄今已成功構建了多種基因重組抗體。基因工程抗體是從雜交瘤、免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等中提取mRNA，反轉錄成cDNA，PCR擴增出抗體基因，按一定方式連接到表達載體中，在適當的細胞中表達并折疊成有功能的抗體分子片段。

根據抗體基因的不同來源，基因工程抗體可分為嵌合抗體、改型抗體、全人源化抗體等；根據抗體結構，基因工程抗體可分為Fab抗體、Fc抗體和單鏈抗體(ScFv)、單域抗體(SdAb)等 ^[1]。Fab 是抗體上與抗原結合的區域，包含輕鏈可變區（VL）、恒定區和重鏈可變區（VH）、CH1 區。scFv是VH與VL的融合蛋白，連接肽通常富含甘氨酸以提高柔韌性，可將VH的N端（或C端）與VL的C端（或N端）相連 ^[2]。雖然去除了C區并加入連接肽，但scFv仍然保留了原免疫球蛋白的特異性。sdAb也稱納米抗體，它的發現基于駱駝和鯊魚體內天然缺失輕鏈的重鏈抗體。sdAb是已知最小的功能性抗原結合片段，大小僅14 ku，結構簡單，易于在細菌和酵母中表達 ^[3]，特別適合基因工程方法。scFv是最常用的抗體類型，可能是因為考慮到抗體與小分子的結合效率。雖然sdAb可單獨識別小分子，但親和力往往不夠理想。單從親和力角度考慮，Fab與scFv相比沒有特別的優勢，反而雙倍的體積會在構建抗體文庫和淘選過程中帶來不便。雖然缺失C區而易于多聚化一直是scFv的不足，但通過開發雙特異性抗體可以克服這個缺點。

基因重組抗體具有分子量小、免疫原性低、可塑性強及成本低等優點。尤其是對于化學或者熱變性具有更高的抗性，可以解決一些待測樣本中目標檢測化合物提取有機試劑含量高及免疫分析產品的穩定性問題。

三、其他新型抗體

適配體通過配體指數富集的系統進化技術，基于組合化學原理，能從構建的大容量寡核甘酸文庫中，經反復分離和擴增步驟最終篩選出針對靶分子的高親和力高特異性配體，即適配體。適配體的優越性如不受免疫條件和免疫原性限制，可體外人工合成，變性與復性可逆，可修飾并易于長期保存和室溫運輸等。目前已報道一些小分子化合物的適配體，如金屬離子、非法添加物、抗生素等。

抗轉運蛋白由脂質運載蛋白經過隨機肽庫突變技術獲得的一類具有抗體功能的蛋白質，稱為抗轉運蛋白。抗轉運蛋白只有180個氨基酸殘基，分子量很小。目前已報道的小分子化合物抗轉運蛋自有熒光素、地高辛、克百威等。

受體作為特異性識別的物質，因其分離純化和體外構建均較復雜，應用于免疫分析的報道較少，比如內酰胺類受體。

小分子化合物抗體制備現階段依然是傳統多克隆抗體和單克隆抗體占主導地位。隨著基因工程技術、材料學及信息學等技術的發展，抗體發現技術更加多樣化，新型抗體技術在簡單、廉價、快速，易于自動化和提高篩選效率等方面優勢會更加凸顯，將逐步取代傳代抗體。

參考文獻：

[1] HOLLIGER P, HUDSON P J. Engineered antibody fragments and the rise of single domains[J]. Nature Biotechnology, 2005, 23(9); 1126-1136.

[2] SCHIRRMANN T. Tumorspezifische targeting der humanen natürlichen killerzellinie YT durch gentransfer chimürer immunglobulin tzellrezeptoren[D].Berlin: Universit?tsklinikum Charité, 2005.

[3] LEE C M, IORNO N, SIERRO F, et al. Selection of human antibody fragments by phage display[J]. Nature Protocols, 2007, 2(11):3001-3008.