實(shí)驗(yàn)技術(shù)|蛋白免疫印跡WB（下）
日期：2019-03-27 09:38:53
科研就像賽跑，你比別人跑的快，就比別人多發(fā)幾篇SCI~
前兩期，給朋友們帶來了
做了很久的WB，走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實(shí)驗(yàn)中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應(yīng)的解決方案，才是實(shí)驗(yàn)成功的基石。
蛋白免疫印跡（WB）是基于抗原抗體的特異性結(jié)合作用，以檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白，并對其進(jìn)行半定量分析的一種方法。
主要用于靶標(biāo)蛋白特異性表達(dá)的定性或半定量分析，蛋白與蛋白或蛋白與DNA相互作用的后續(xù)分析，以及蛋白修飾的鑒定分析。
1.為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
原因有很多：
a) 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；
b) 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；
c) 抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；
d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長。
2.我做的蛋白質(zhì)分子量很?。?0 kDa），請問怎么做WB？
a)可以選擇PSQ膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可；
b)也可選擇孔徑0.22 μm的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。
3.我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？
a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；
b)也可以將一抗稀釋比例降低；
c)還可以延長曝光時(shí)間。
4.DAB好還是ECL好？
DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。
5.膠片是一片空白，是怎么回事？
如果能夠排除下面的幾個(gè)問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；
d) 一抗選擇不當(dāng)二抗失活；
e) 二抗失活。
6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？
NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。
7.細(xì)胞水平要做WB，多少細(xì)胞提的蛋白夠做WB？
一般5×10^6就足夠。
8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5 mm的。
9.大分子量蛋白200 kDa，在做WB要注意什么？
a) 做200kDa蛋白的WB時(shí)要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時(shí)要小心；
b) 轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。
c) 轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!
10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？
免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
11.WB中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？
抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4℃保存，避免反復(fù)凍融。
12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？
無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。
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1.蛋白樣品準(zhǔn)備
2.蛋白定量
3.上樣
4.凝膠電泳
5.轉(zhuǎn)膜
6.封閉
7.孵育一抗
8.孵育二抗
9.顯影
10.常見問題
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