來自伊利諾斯大學大學，加州大學伯克利分校，霍華德休斯醫學院等處的研究人員利用一種單分子熒光分析技術發現了重要的DNA解旋酶：Bacillus stearothermophilus PcrA的作用機制。這一研究成果公布在Cell雜志上。

領導這一研究的是伊利諾斯大學大學，HHMI知名的研究員Taekjip Ha教授，這位2005年加入HHMI的科學家專注于DNA與蛋白相互作用過程中的生物物理學分析，揭示了許多包括DNA修復，酶作用過程機制。

類似解旋酶的蛋白與核酸相互位置的轉變具有重要的細胞生物學意義，但是至今科學家們還并不清楚這個過程如何解開DNA結合蛋白，而且這一過程的基本特征迄今為止仍然倍受爭議。

DNA修復指雙鏈DNA上的損傷得到修復的現象，這個過程可能使DNA結構恢復原樣，重新能執行它原來的功能，DNA修復是探索生命的一個重要方面，而且與遺傳疾病、腫瘤學等密切相關。對不同的DNA損傷，細胞可以有不同的修復反應。

DNA解鏈酶在DNA不連續復制過程中，結合于復制叉前面，催化DNA雙鏈結構解鏈，并具有ATP酶活性的酶，兩種活性相互偶聯，通過水解ATP提供解鏈的能量。不同來源的DNA解旋酶的共同特性是通過水解ATP提供解鏈的能量，而復制叉結構的存在與否對活性的影響因酶而異。

在這篇文章中，研究人員利用單分子熒光共振能量轉移技術（FRET）解析了這一過程，如下圖所示，這種PcrA螺旋酶通過2B位點結合在模板鏈上，沿著滯后鏈滑動，形成一個單鏈環，從而反復的，統一步驟的完成功能。這個過程需要PcrA開放性的結構，能快速的替換RecA，這為分析DNA復制過程提供了一種新模型。

這個過程使用了兩種染料，這些染料熒光強度可根據它們之間的靠近距離發生改變。研究人員將兩種染料分別連接到單鏈DNA的兩個末端，從而能直接觀察到DNA鏈的作用方式，他們發現這兩種染料能相互靠近，然后又分開，這樣重復，其中PcrA并沒有沿著單鏈尾部移動，而是與DNA鏈斷裂端結合，拉動DNA使之與結合蛋白分離。當這一過程結束的時候，PcrA就會松開。

這里運用到的單分子熒光技術實際上就是大家熟悉的單分子熒光共振能量轉移技術，這種技術是指當兩種不同的熒光生色團離的較近，且其中一種生色團（供體, donor）的發射譜與另一種生色團（受體, acceptor）的激發譜有相當程度的重疊時，當供體被激發時，受體會因供體激發能的轉移而被激發。其直觀表現就是供體產生的熒光強度較其單獨存在時要低的多，而受體發射的熒光卻大大增強，同時伴隨它們熒光壽命的相應縮短和延長。

這種技術是目前研究蛋白質相互作用比較成熟、已被廣泛應用的幾種方法之一，而用于DNA與蛋白之間的相互作用關系研究則是近年來動態結構生物學研究領域關注的焦點。

用單分子熒光光譜技術研究生物分子構象變化的方法主要有兩種：一是通過單分子熒光偏 振 的 各 向 異 性 （ single molecule fluorescencepolarization anisotropy，smFPA）研究生物分子的構象動力學(conformational dynamics)和旋轉運動(rotational motions)。另一個是單分子對熒光共振能量轉移(single pair fluorescence resonance energytransfer, spFRET)，在單分子水平測量一個分子內或兩個不同分子間的距離變化和相互作用。

在幾年前，Taekjip Ha教授研究組就利用這一方法研究分析了DNA解旋酶，他們用熒光染料做上了標記：給Rep（DNA解旋酶中作為引擎的那部分結構）加上了綠色熒光蛋白，給DNA鏈末端加上了紅色熒光蛋白，觀測一個熒光分子如何傳遞能量給另一個從而獲知被標記的分子相對于另一個被標記的分子是如何運動的。

研究人員發現當Rep靠近到DNA鏈末端阻隔時，這個酶并沒有停在那兒而是跳回到了DNA鏈的開端重新開始，如果仍然“讀”不過去，Rep就會重復這個過程。這也是Taekjip Ha教授利用FRET成功分析DNA復制過程的一個范例。

單分子FRET是對單個分子的熒光特性進行檢測的過程，因為幾乎所有的分子生物學實驗結果只代表測量時間內大量分子的平均行為 ,而生物體系一般來說都是不均勻體系 ,尤其對于生物大分子而言 。因此監測單個生物大分子的行為具有重要意義。

FRET最基本的原理是通過易于檢測的熒光共振能量轉移的效率信息來反映兩分子團的距離信息，而距離接近到 10 nm之間是兩分子相互作用或一個分子的兩個結構域因構象改變而相互靠近的有力證據。通過 FRET效率的增強可檢測分子間發生相互作用或構象改變而靠近;FRET效率的減弱可用于證明兩分子遠離因而失去相互作用，或證明一個分子的兩個部分間因分子被切斷或構象改變而相互遠離。

在分子水平上研究任何生物學機制都可以運用FRET技術，關鍵在于找到合適的熒光探針和檢測設備。事實上FRET方法的應用領域非常廣泛。近年來在核蛋白機制、細胞外基質、生物膜功能、信號轉導等多個方向領域都可以找到FRET技術的應用案例。這一技術無疑已成為細胞分子機制研究的重要工具。