1. 什么是細(xì)胞存活率？

細(xì)胞存活率是一個(gè)群體中存活細(xì)胞的比例測量。細(xì)胞存活率是一個(gè)以百分比表示的相對測量。它通常與細(xì)胞健康和細(xì)胞群體的生存和成功功能能力相一致。

2. 為什么要測量細(xì)胞存活率？

細(xì)胞存活率的測量旨在量化樣本中的整體健康細(xì)胞，并評估細(xì)胞對各種處理和刺激的反應(yīng)。

例如，細(xì)胞存活率測定有助于篩選化學(xué)物質(zhì)對各種細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并在癌癥化療中選擇抗癌藥物及其劑量。

測量從組織中分離的細(xì)胞的存活率，以了解分離過程是否損傷了細(xì)胞。

在復(fù)蘇后，應(yīng)該檢查細(xì)胞存活率，以了解冷凍和復(fù)蘇的影響。

有時(shí)，細(xì)胞存活率測定也用于優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)或環(huán)境條件。

或者，細(xì)胞變異性可以用于相關(guān)細(xì)胞行為以及細(xì)胞數(shù)量，從而提供對細(xì)胞代謝的詳細(xì)分析。

3. 什么是細(xì)胞存活率的指標(biāo)？

細(xì)胞存活率反映了細(xì)胞群體的整體健康情況。因此，細(xì)胞膜滲透性、細(xì)胞代謝活性、ATP產(chǎn)生、酶活性和增殖能力可以指示細(xì)胞的存活率 ^[2]。

4. 細(xì)胞存活率檢測方法

細(xì)胞存活率可以通過許多方法進(jìn)行評估，從最簡單且廣泛使用的染料排除法到對ATP含量和酶活性進(jìn)行高度復(fù)雜的分析。選擇最佳的存活率測定方法應(yīng)該詳細(xì)考慮細(xì)胞類型、應(yīng)用的培養(yǎng)條件以及所需設(shè)備的成本、速度和復(fù)雜性。

4.1 染料排除法

染料排除法是用于細(xì)胞存活率鑒定的簡單且最常用的方法之一。染料排除法的原理是死細(xì)胞會吸收染料并變色，而活細(xì)胞會排除染料，因?yàn)樗鼈兙哂型暾募?xì)胞膜。因此，可以使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算死細(xì)胞（著色）或存活細(xì)胞（無色）的數(shù)量。在多種使用的染料中，嘗試藍(lán)是其中最常用的。在嘗試藍(lán)染色中，死細(xì)胞被染成藍(lán)色，活細(xì)胞則不被染色[3]。然而，凋亡細(xì)胞在染料排除法中也被計(jì)算為存活細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞膜仍然完整。因此，在可靠的細(xì)胞存活率和健康研究中，通常會通過流式細(xì)胞術(shù)測量凋亡細(xì)胞的水平以及存活細(xì)胞的數(shù)量。

4.2 細(xì)胞增殖測定

健康細(xì)胞會積極增殖，而受限、老化、死亡或垂死的細(xì)胞則不能。因此，細(xì)胞增殖測試是評估細(xì)胞存活率的有用工具。通過測量DNA合成和免疫染色細(xì)胞周期特異性蛋白質(zhì)可以進(jìn)行細(xì)胞增殖測定。許多生物公司開發(fā)了基于熒光微孔板的細(xì)胞增殖測定試劑盒，用于定量細(xì)胞并評估細(xì)胞增殖。最常用的增殖蛋白包括增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）^[4]、MKI67 ^[5]、磷酸組蛋白H3（H3-3A）^[6]和MCM2 ^[7]，可以通過WB、IF、IHC、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA進(jìn)行檢測。

4.3 比色法測定

代謝活性通常通過檢測細(xì)胞還原能力來評估。在活細(xì)胞中，NADPH將四唑鹽，包括MTT、MTS和XTT還原為紫色的嗎啉衍生物。MTT比色法是第一種用于適用于高通量篩選（HTS）的96孔板格式的均質(zhì)細(xì)胞存活率測定方法 ^{[8] [9]}。在存活細(xì)胞中，黃色的MTT被還原為紫色的嗎啉。MTT測定中產(chǎn)生的嗎啉衍生物的數(shù)量通過在560 nm處通過分光光度法記錄吸光度讀數(shù)來測量，并且與存活細(xì)胞的數(shù)量直接成正比。MTS方法在原理上與MTT測定類似，但在靈敏度和操作上更高 ^[10]。

圖. MTT試驗(yàn)

4.4 生物發(fā)光測定法

生物發(fā)光測定法可以快速、簡單地確定哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性。細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性可以間接反映細(xì)胞存活率。

● ATP測定

基于ATP的細(xì)胞存活率測定是一種敏感可靠的方法。只有存活細(xì)胞能夠合成ATP。內(nèi)源性ATP是活細(xì)胞最基本的能源來源。當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，ATP會迅速水解。因此，內(nèi)源性ATP含量的測定可以及時(shí)反映細(xì)胞的活性和存活率。

基于ATP的細(xì)胞存活率測定的反應(yīng)原理是，在Mg2+和ATP的存在下，熒光酶催化熒光素氧化為氧化熒光素，產(chǎn)生與細(xì)胞內(nèi)ATP濃度成比例的發(fā)光信號 ^[11-13]。因此，產(chǎn)生的信號強(qiáng)度間接地反映了存活細(xì)胞的相對數(shù)量 ^[14]。

● 實(shí)時(shí)存活率測定

實(shí)時(shí)存活率測定是一種新開發(fā)的生物發(fā)光測定法，可以在整個(gè)時(shí)間過程中監(jiān)測細(xì)胞的生長。Duellman SJ及其同事在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了一種小分子前底物和一種源自海洋蝦的工程熒光酶作為試劑。需要注意的是，前底物不是熒光酶的底物。在活細(xì)胞中，前底物被還原為底物，熒光酶催化產(chǎn)生發(fā)光信號。該發(fā)光信號可以在長時(shí)間內(nèi)從樣品孔中重復(fù)記錄，以實(shí)時(shí)測量細(xì)胞數(shù)量 ^[15]。

4.5 酶活性

與非存活細(xì)胞不同，存活細(xì)胞具有神秘的活性。酯酶活性，作為底物的衡量，例如不發(fā)光的細(xì)胞可滲透染料羧基氟熒光素二乙酸酯（CFDA），通常用作總體酶活性的指標(biāo)。進(jìn)入活細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)酯酶將CFDA水解為羧基氟熒光素，這是一種帶負(fù)電的熒光分子。羧基氟熒光素在活細(xì)胞中不共價(jià)地保留，并產(chǎn)生綠色熒光。發(fā)光強(qiáng)度與存活細(xì)胞的數(shù)量正相關(guān)。

5. 不同檢測方法的比較

上述細(xì)胞存活率測定法各有優(yōu)劣。下表分別列出了它們的特點(diǎn)。

6. 細(xì)胞存活率、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖

細(xì)胞存活率、細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖是細(xì)胞的三種不同生理狀態(tài)。它們都反映了細(xì)胞是活著的。然而，存活率是對細(xì)胞群體中存活細(xì)胞數(shù)量的量化，而細(xì)胞增殖是在一段時(shí)間內(nèi)測量細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo) ^[16]。細(xì)胞存活率測定方法，如染料排除法，只是區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。細(xì)胞增殖的測量可以監(jiān)測一段時(shí)間內(nèi)細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞分裂次數(shù)、代謝活性或DNA合成。然而，并非所有存活細(xì)胞都會分裂。盡管細(xì)胞增殖可以輕松解釋為存活率，但非增殖不應(yīng)自動被視為細(xì)胞死亡的標(biāo)志。

除了細(xì)胞死亡，化學(xué)或物理因素的毒性效應(yīng)可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死（細(xì)胞代謝和生理后果阻止細(xì)胞分裂），但細(xì)胞本身仍然可能存活 ^[17]。這種現(xiàn)象被稱為“細(xì)胞活力”，即細(xì)胞的生理能力。

目前，在毒理學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)應(yīng)用了各種細(xì)胞存活率測定方法。理想的體外存活率測定方法應(yīng)該是快速、安全、可靠、高效、及時(shí)和經(jīng)濟(jì)，并且不干擾測試化合物。測試化合物的作用模式、組織或細(xì)胞類型在研究中的使用也會影響細(xì)胞存活率測定方法的性能。因此，在選擇測試方法之前最好嘗試并比較不同的方法。如果可能，在體外研究中應(yīng)該使用多種檢測方法來確定細(xì)胞存活率，從而獲得可靠和準(zhǔn)確的結(jié)果。