PD-1——重要的免疫檢查點(diǎn)
日期：2019-11-19 14:52:03
程序性死亡分子(Programmed death-1, PD-1)又名CD279，是繼CTLA4發(fā)現(xiàn)之后又一個(gè)重要的負(fù)性共刺激分子。它的配體PD-L1，又名CD274，同屬CD28/B7超家族。PD-1與其配體結(jié)合后，傳導(dǎo)的負(fù)性共刺激信號(hào)能抑制T淋巴細(xì)胞增殖，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化和免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，對(duì)防止自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。
1. PD-1的結(jié)構(gòu)
PD-1是在T細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行活化誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)，因此得名[1]，屬B7-CD28家族成員之一。
PD-1基因位于人類染色體2q37上，所編碼的蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量為50 kDa-55 kDa的I型跨膜糖蛋白，由于缺乏在近膜處能形成同源二聚體的半胱氨酸，以單體形式表達(dá)于細(xì)胞膜表面。
PD-1蛋白由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成。
其中，胞外區(qū)含有一個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。PD-1胞內(nèi)區(qū)含有免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM）及免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序（immunoreceptor tyrosine-based Switch motif, ITSM），這兩種基序各含有1個(gè)酪氨酸。
當(dāng)PD-1與其配體結(jié)合時(shí)，兩個(gè)酪氨酸均發(fā)生磷酸化，但是ITIM并不轉(zhuǎn)導(dǎo)PD-1信號(hào)通路的抑制信號(hào)，只有ITSM的C末端酪氨酸的磷酸化可使PD-1發(fā)揮調(diào)控作用。
2. PD-1的表達(dá)
PD-1主要在活化的CD4+ 和CD8+ T細(xì)胞，活化B細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞（DC）及活化的單核細(xì)胞中表達(dá)，并與它們的分化和凋亡密切相關(guān)。
PD-1的表達(dá)可被TCR或B細(xì)胞受體誘導(dǎo)，腫瘤壞死因子可增強(qiáng)PD-1的表達(dá)。
PD-1的廣泛表達(dá)提示其在維持機(jī)體負(fù)性免疫應(yīng)答中具有必不可少的作用。
3. PD-1的配體
PD-1的配體主要有PD-L1和PD-L2，其中PD-L1是主要配體[2]，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)。
圖1. PD-1的配體
3.1 PD-L1
PD-L1(B7-H1、CD274)是PD-1的配體，該基因位于人類染色體9p24。
它是由Dong等[3]于1999年發(fā)現(xiàn)的，是B7家族的新成員。
3.1.1 PD-L1的結(jié)構(gòu)
PD-L1是一種40kDa的I型跨膜糖蛋白，由胞外段、疏水跨膜段和短的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。
胞膜外區(qū)有1個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)(IgC)結(jié)構(gòu)域和1個(gè)免疫球蛋白可變區(qū)(IgV)結(jié)構(gòu)域。PD-L1細(xì)胞質(zhì)區(qū)含有一個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，但胞內(nèi)區(qū)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基序目前尚不明確。
3.1.2 PD-L1的表達(dá)
CD274在心臟、骨骼肌、胎盤(pán)和肺中高表達(dá)，在胸腺、脾臟、腎臟和肝臟中弱表達(dá)。PD-L1表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞和培養(yǎng)的骨髓衍生肥大細(xì)胞上，且在活化后的細(xì)胞上表達(dá)明顯上調(diào)。
在非造血系統(tǒng)中，PD-L1表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞、胰島細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞、胎盤(pán)，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。
PD-L1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，如人肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎癌和黑色素瘤等。
3.2 PD-L2
PD-L2是由Freeman實(shí)驗(yàn)室鑒定出來(lái)的[4]。人PD-L2(B7-H2、CD273)基因同樣位于染色體9p24，編碼247個(gè)氨基酸的I型跨膜蛋白。PD-L1和PD-L2兩者的同源性為40％。PD-L2與PD-1的親和力是PD-L1的2～6倍。
與PD-L1相比，PD-L2的表達(dá)相對(duì)較局限，PD-L2誘導(dǎo)性表達(dá)于樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞等細(xì)胞表面[5] [6]。人的PD-L2也表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上。
4. PD-L1/PD-1信號(hào)通路
PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后，PD-1胞質(zhì)區(qū)ITSM結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，招募SHP2磷酸酶類分子至胞膜內(nèi)側(cè)[7]，發(fā)揮對(duì)下游信號(hào)的負(fù)調(diào)控，進(jìn)一步抑制PI3K/PKB介導(dǎo)的Zap-70/CD3ζ和PKCθ磷酸化，抑制T細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞因子產(chǎn)生[8] [9]。
圖2. PD-L1/PD-1信號(hào)通路
4.1 PD-1/PD-L1信號(hào)通路的功能
IFN-γ上調(diào)正常組織細(xì)胞和不同腫瘤組織細(xì)胞表面的PD-L1，通過(guò)誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)來(lái)下調(diào)腫瘤微環(huán)境的免疫應(yīng)答。PD-1在T細(xì)胞受到炎癥信號(hào)刺激后被誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且在以感染和腫瘤為主的多種外周組織中限制T細(xì)胞的功能，由此可限制免疫反應(yīng)的放大和持續(xù)時(shí)間，從而避免正常組織的損傷。
雖然PD-L1和PD-1上調(diào)的生理功能是為了避免炎癥擴(kuò)大，降低組織損傷，但是腫瘤微環(huán)境中誘導(dǎo)產(chǎn)生的PD-L1會(huì)促進(jìn)活化的T細(xì)胞凋亡，也會(huì)刺激人外周血Ｔ細(xì)胞產(chǎn)生IL-10來(lái)調(diào)節(jié)免疫抑制。
PD-1/PD-L1的相互作用在體內(nèi)抑制Ｔ細(xì)胞方面起到重要作用。PD-L1與T細(xì)胞膜上的受體PD-1結(jié)合產(chǎn)生抑制信號(hào)，可阻止CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞增殖、活化，下調(diào)一些抗凋亡分子和促炎因子的表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，使機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視及清除能力減弱，產(chǎn)生免疫逃逸，從而讓腫瘤細(xì)胞能在機(jī)體內(nèi)無(wú)限增殖[10]。因此，阻斷PD-1／PD-L1通路可以恢復(fù)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
4.2 PD-1/PD-L1信號(hào)通路與疾病
PD-1與其主要配體PD-L1結(jié)合形成PD-1/PD-L1信號(hào)通路，該信號(hào)通路在維持外周耐受和調(diào)節(jié)抗原特異性T細(xì)胞活性及其介導(dǎo)的炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的作用，是感染性疾病慢性化和自身免疫性疾病的重要影響因素。
PD-1/PD-L通路對(duì)自身免疫性疾病和移植排斥反應(yīng)有積極的調(diào)控作用，但在抗病毒、抗腫瘤方面則起到消極的作用。
4.2.1 PD-1/PD-L1信號(hào)通路與慢性病毒感染
病毒感染可導(dǎo)致抗原特異性T細(xì)胞表面PD-1、PD-L1表達(dá)升高，抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖，減少細(xì)胞因子白細(xì)胞介素2（IL-2）、干擾素γ（IFN-γ）分泌或擴(kuò)散，引起特異性T淋巴細(xì)胞免疫功能降低，甚至衰竭。這削弱宿主的抗感染免疫反應(yīng)，導(dǎo)致靶器官損傷，最終引起病毒持續(xù)感染等相關(guān)疾病的發(fā)生。這表明PD-1/PD-L1通路可能是慢性病毒感染以及疾病慢性化的主要原因之一。
PD-1/PD-L通路被證實(shí)與HIV、HBV、HCV感染[11]等T細(xì)胞相關(guān)的慢性病毒感染有關(guān)。
在慢性病毒感染中，用抗體阻滯PD-1，CD8+T細(xì)胞能重新活化、增殖和分化，并恢復(fù)其殺病毒能力，使病毒滴度下降[12]。
4.2.2 PD-1/PD-L與自身免疫病
作為一個(gè)關(guān)鍵的共抑制分子，PD-1的基因多態(tài)性與自身免疫病的易感性存在聯(lián)系，表明PD-1可能在自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[13]。
- 系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)
這是一類系統(tǒng)性自身免疫病。研究發(fā)現(xiàn)[14]，PD-1基因在人染色體上的位點(diǎn)恰好是SLE發(fā)生的高敏感性候選位點(diǎn)。
PD-1基因位點(diǎn)頻率異常引起PD-1表達(dá)下降，從而使PD-1/PD-L信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常而導(dǎo)致SLE發(fā)生。
PD-1的表達(dá)下降與PD-1.3A/G等位基因有關(guān)，可能是因?yàn)镻D-1.3的基因多態(tài)性破壞了Runt相關(guān)蛋白1的DNA結(jié)合位點(diǎn)，使PD-1基因轉(zhuǎn)錄水平下降，引起T細(xì)胞等異?；罨驮鲋常瑥亩T導(dǎo)SLE發(fā)生。
- PD-1/PD-L與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性炎性自身免疫病，該疾病的基本病理特點(diǎn)為慢性滑膜炎和滑膜增生。
T細(xì)胞參與了RA發(fā)生，外周血T細(xì)胞的異常增殖分化啟動(dòng)RA的發(fā)生，同時(shí)促進(jìn)慢性炎性反應(yīng)。
RA病人CD4+和CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)的PD-1和血清中可溶性PD-1(soluble PD-1，sPD-1)的水平均降低[15]。這表明PD-1通過(guò)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性參與了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。
4.2.3 PD-1/PD-L與腫瘤
在人體內(nèi)，腫瘤組織上表達(dá)的抗原雖然可被宿主的T細(xì)胞識(shí)別，但不一定被清除。原因之一就是腫瘤微環(huán)境中PD-L1和PD-1的上調(diào)表達(dá)。PD-L1在腫瘤組織(如淋巴瘤、絨毛膜癌、黑色素瘤、食管癌)中的表達(dá)以及PD-1在腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上的表達(dá)上調(diào)參與了相關(guān)的免疫抑制信號(hào)傳導(dǎo)。
PD-1/PD-L1信號(hào)通路的激活抑制了CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞增殖、活化，抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，使機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視及清除能力減弱，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視和殺傷[16]。因此，PD-1/PD-L通路成為治療腫瘤的新的作用靶點(diǎn)。
圖3. PD-1/PD-L1信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系
5. PD-1/PD-L在治療方面的應(yīng)用
PD-1和PD-L1信號(hào)通路在感染免疫、腫瘤免疫、移植免疫中起著重要作用，這使得靶向PD-1/PD-L1信號(hào)通路成為治療腫瘤的研究熱點(diǎn)。
免疫檢查點(diǎn)阻滯劑PD-1/PD-L1抗體類藥物的研發(fā)是目前腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。PD-1/PD-L1抗體作為腫瘤免疫治療方法之一，通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)通路，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，增強(qiáng)內(nèi)源性抗腫瘤免疫效應(yīng)。
作用于PD-1/PD-L1信號(hào)通路的抗體分為兩類，包括抗PD-1抗體和抗PD-L1抗體?？筆D-1抗體能夠阻斷PD-1與PD-L1及PD-L2的相互作用，而抗PD-L1抗體僅能阻斷PD-1與PD-L1的相互作用，卻不能阻斷PD-1與PD-L2的相互作用。目前主要的抗PD-1/PD-1抗體有nivolumab、Pembrolizumab、ipidilizumab、(avelumab、atezolizumab和durvalumab)。其中nivolumab和pembrolizumab是PD-1抗體，avelumab、atezolizumab和durvalumab是PD-L1抗體。
Nivolumab已被批準(zhǔn)用于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、腎細(xì)胞癌(RCC)、膀胱癌(BC)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或錯(cuò)配修復(fù)缺陷(MSI-H/dMMR)的結(jié)直腸癌(CRC)、肝細(xì)胞癌(HCC)、經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(cHL)、黑色素瘤和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSCC)的治療。
Pembrolizumab已經(jīng)被批準(zhǔn)用于黑色素瘤、HNSCC、宮頸癌、cHL、NSCLC、BC、胃癌和胃食道癌，以及所有被歸類為MSI-H/dMMR的晚期實(shí)體腫瘤。
Avelumab已被批準(zhǔn)用于治療默克爾細(xì)胞癌和BC。
Atezolizumab已經(jīng)被批準(zhǔn)用于NSCLC和膀胱癌。
Durvalumab已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療膀胱癌和NSCLC (III期)。
在黑色素瘤Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，PD-1抗體nivolumab和Pembrolizumab這兩種藥物的療效都得到了認(rèn)可。此外，PD-1抗體在肺癌和卵巢癌也得到了應(yīng)用。
6. PD-1抑制劑毒副反應(yīng)
PD-1抑制劑雖然有驚人療效，但是也誘發(fā)了免疫相關(guān)的毒副反應(yīng)（immune-related adverse events, irAEs）。
這可能與免疫檢查點(diǎn)通路維持人體免疫穩(wěn)態(tài)的作用被破壞相關(guān)[17]。即通過(guò)靶向阻斷免疫檢查點(diǎn)等負(fù)調(diào)節(jié)因子，增強(qiáng)Ｔ細(xì)胞的活性，導(dǎo)致免疫過(guò)強(qiáng)化，在達(dá)到抗腫瘤效果的同時(shí)不可避免產(chǎn)生對(duì)正常組織的損傷。
PD-1蛋白
Recombinant Human Programmed cell death protein 1(PDCD1),partial (Active) (Code: CSB-MP619964HU1)
(Tris-Glycine gel) Discontinuous SDS-PAGE (reduced) with 5% enrichment gel and 15% separation gel.
Immobilized PD-1 at 2 μg/ml can bind Anti-PD-1 recombinant antibody, the EC50 of human PD-1 protein is 6.087-7.854 ng/ml.
References
[1] Ishida Y, Agata Y, Shibahara K, et al. Induced expression of PD‐1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death [J]. The EMBO journal, 1992, 11(11): 3887-3895.
[2] Hams E, McCarron M J, Amu S, et al. Blockade of B7-H1 (programmed death ligand 1) enhances humoral immunity by positively regulating the generation of T follicular helper cells [J]. The Journal of Immunology, 2011, 186(10): 5648-5655.
[3] Dong H, Zhu G, Tamada K, et al. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion [J]. Nature medicine, 1999, 5(12): 1365.
[4] Latchman Y, Wood C R, Chernova T, et al. PD-L2 is a second ligand for PD-1 and inhibits T cell activation [J]. Nature immunology, 2001, 2(3): 261.
[5] Ghiotto M, Gauthier L, Serriari N, et al. PD-L1 and PD-L2 differ in their molecular mechanisms of interaction with PD-1 [J]. International immunology, 2010, 22(8): 651-660.
[6] Keir M E, Butte M J, Freeman G J, et al. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity [J]. Annu. Rev. Immunol., 2008,26: 677-704.
[7] Sheppard K A, Fitz L J, Lee J M, et al. PD‐1 inhibits T‐cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3ζ signalosome and downstream signaling to PKCθ [J]. FEBS letters, 2004, 574(1-3): 37-41.
[8] Chemnitz J M, Parry R V, Nichols K E, et al. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation [J]. The Journal of Immunology, 2004, 173(2): 945-954.
[9] Riley J L. PD‐1 signaling in primary T cells [J]. Immunological reviews, 2009, 229(1): 114-125.
[10] Ramsay A G. Immune checkpoint blockade immunotherapy to activate anti‐tumour T‐cell immunity [J]. British journal of haematology, 2013, 162(3): 313-325.
[11] Hofmeyer K A, Jeon H, Zang X. The PD-1/PD-L1 (B7-H1) pathway in chronic infection-induced cytotoxic T lymphocyte exhaustion [J]. BioMed Research International, 2011, 2011.
[12] Watanabe T, Bertoletti A, Tanoto T A. PD-1/PD-L1 pathway and T-cell exhaustion in chronic hepatitis virus infection [J]. Journal of viral hepatitis, 2010, 17(7): 453-458.
[13] Suarez-Gestal M, Ferreiros-Vidal I, Ortiz J A, et al. Analysis of the functional relevance of a putative regulatory SNP of PDCD1, PD1.3, associated with systemic lupus erythematosus [J]. Genes and immunity, 2008, 9(4): 309.
[14] Prokunina L, Castillejo-López C, öberg F, et al. A regulatory polymorphism in PDCD1 is associated with susceptibility to systemic lupus erythematosus in humans [J]. Nature genetics, 2002, 32(4): 666.
[15] Li S, Liao W, Chen M, et al. Expression of programmed death-1 (PD-1) on CD4+ and CD8+ T cells in rheumatoid arthritis [J]. Inflammation, 2014, 37(1): 116-121.
[16] Quezada S A, Peggs K S. Exploiting CTLA-4, PD-1 and PD-L1 to reactivate the host immune response against cancer [J]. British journal of cancer, 2013, 108(8): 1560.
[17] Michot J M, Bigenwald C, Champiat S, et al. Immune-related adverse events with immune checkpoint blockade: a comprehensive review [J]. European journal of cancer, 2016, 54: 139-148.
