【干貨收藏貼】WB常見問題精品全集錦
日期：2017-12-19 13:31:31
做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，但是WB想要做好并不難，總結(jié)WB實驗中可能會遇到的問題，分析可能的原因及對應的解決方案，這就是實驗成功的基石。 以下，我們先解決很多技術菌的疑惑，然后再著手匯總實驗中常見問題和可能原因分析以及給出建議解決方案。 靜心閱讀十分鐘 實驗問題全想通 WB常見問題分析
1.為什么我的細胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？
原因有很多：
a) 細胞中不表達這種蛋白質(zhì)，換一種細胞；
b) 細胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性；
c) 抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，是否有問題；
d) 酶降解可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當，樣品放置時間過長。
2.我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KDa），請問怎么做WB？
a)可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可；
b)也可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時間縮短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE體系。
3.我的目的帶很弱，如何加強？
a)可以加大抗原上樣量，這是最主要的；
b)也可以將一抗稀釋比例降低；
c)還可以延長曝光時間。
4.DAB好還是ECL好？
DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；
ECL結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。
5.膠片是一片空白，是怎么回事？
如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。
a) 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光；
b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；
c) ECL底物沒覆蓋到相應位置；
d) 一抗選擇不當二抗失活；
e) 二抗失活。
6.磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？
NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
7.細胞水平要做WB，多少細胞提的蛋白夠做WB？
一般5×106就足夠。
8.如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？
可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。
9.大分子量蛋白200KDa，在做WB要注意什么？
a) 做200kd蛋白的WB時要注意，分離膠最好選擇>7%的；剝膠時要小心；
b) 轉(zhuǎn)移時間需要相應延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。
c) 轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦!
10.免疫組化和WB可以用同一種抗體嗎？
免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時用于免疫組化和WB，而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
11.WB中抗體的可以重復應用嗎？
抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用，但是如抗體比較珍貴，可反復使用2－3次。稀釋后應在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。
12.上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達到最佳效果？
無特殊要求。但一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復使用過一兩次的緩沖液。
WB 實驗中常會出現(xiàn)各種問題，華美生物專注于生產(chǎn)免疫檢測相關產(chǎn)品多年，同時也跟技術菌們一起分享下 WB 實驗中各種問題及應用對策，希望給您的實驗帶來實實在在的幫助~
WB問題匯總及解決建議
| 問題 | 原因 | 解決方案 |
| 條帶形狀不好看 | 膠凝的不均勻，聚合不好 | 灌膠前將溶液充分混勻 |
| 某些樣品鹽濃度較高 | 除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致 | |
| 緩沖液陳舊，成分改變 | 重配 | |
| 凝膠下面有氣泡 | 電泳前先將氣泡趕走 | |
| 電泳時溫度過高 | 降低電流或電壓 | |
| 樣品中含有不溶性顆粒 | 樣品充分攪拌混勻 | |
| 電極不平衡或者加樣位置偏斜 | 調(diào)整電極和加樣 | |
| 蛋白條帶信號弱 | 樣品上樣量不足或目的蛋白濃度過低 | 加大上樣量或濃縮樣品 |
| 轉(zhuǎn)移不完全或過轉(zhuǎn)移 | 可以用麗春紅染膜并結(jié)合染膠（考馬斯亮藍）后確定條帶是否轉(zhuǎn)至膜上或轉(zhuǎn)移過頭；適當調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時間和電流 | |
| 抗體濃度低 | 增加抗體濃度或延長孵育時間 | |
| 封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型 | |
| 顯色劑失效 | 更換顯色劑（吸取A、B液的槍頭不可混用） | |
| 顯色或曝光時間不足 | 延長顯色或曝光時間 | |
| HRP 抑制劑 | 所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊氮化鈉 | |
| 轉(zhuǎn)膜效率低 | 轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值與目的蛋白等電點相近 | 提高轉(zhuǎn)膜緩沖液pH值 |
| 凝膠與膜之間存在氣泡 | 轉(zhuǎn)膜前要排盡氣泡 | |
| 轉(zhuǎn)印膜種類選擇不當 | 使用質(zhì)量可靠的PVDF膜或硝酸纖維素膜 | |
| 電壓或電流過小 | 濕轉(zhuǎn)時20mA恒流，半干轉(zhuǎn)時25V左右恒壓 | |
| 轉(zhuǎn)印時間過長或過短 | 根據(jù)蛋白大小及轉(zhuǎn)印裝置選擇合適的轉(zhuǎn)印時間 | |
| 濕轉(zhuǎn)過程中環(huán)境溫度過高 | 使用預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液或?qū)⒀b置至于4度 | |
| 顯色或曝光后無條帶 | 選用的一抗、二抗及顯色方法不合適 | 選擇合適的一抗、二抗和顯色方法 |
| 目的蛋白含量低于檢測下限 | 加大上樣量或濃縮樣品 | |
| 抗體效價過低 | 增加抗體濃度 | |
| 抗體孵育時間不足 | 延長孵育時間，37°C孵育1小時以上 | |
| 抗體過度洗滌 | 減少洗滌時間及次數(shù)，加入的去垢劑不宜過強或過多 | |
| 加入HRP底物反應與曝光檢測之間間隔時間過長 | 反應3到5分鐘及時檢測 | |
| 背景高 | 膜沒有完全均勻濕透 | 使用100% methanol浸透膜 |
| 洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數(shù) | |
| 封閉物用量不足 | 提高封閉物濃度，孵育時保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜 | |
| 封閉物使用不當 | 檢測生物素標記的蛋白時不可用脫脂奶粉封閉 | |
| 封閉時間不夠 | 室溫37度封閉1小時以上，4度封閉過夜 | |
| 抗體非特異性結(jié)合 | 降低抗體濃度，減少孵育時間 | |
| 一抗稀釋度不適宜 | 對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度 | |
| 一抗孵育的溫度偏高 | 建議4℃結(jié)合過夜 | |
| 抗體濃度過高或洗滌不夠 | 降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時間 | |
| 化學顯色底物過多 | 按說明書加入適量的顯色底物 | |
| 蛋白條帶位置 （大小）不對 |
相對電荷 | 氨基酸電荷的組成 |
| 膠濃度 | 不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，調(diào)整濃度 | |
| 抗體孵育不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 | |
| 酶失活 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物 | |
| 目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體 | 查詢相關文獻確定 | |
| 標本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設置陽性對照比對結(jié)果，增加標本上樣量 | |
| 雜帶多 | 目的蛋白有多個修飾位點，本身可以呈現(xiàn)多條帶 | 查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小 |
| 樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解 | 加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作 | |
| 雜蛋白多 | 處理目的蛋白 | |
| 抗體特異性不強 | 使用特異性強的抗體 | |
| 抗體孵育時間過久 | 減少抗體孵育時間 | |
| 二抗與抗原有交叉反應 | 選擇合適的封閉物 | |
| 二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質(zhì)變性過程及強度 | |
| 底物顯色與曝光時間過長 | 縮短顯色及曝光的時間 | |
| 大分子量WB | 膜孔徑太小 | 更換孔徑較大的膜 |
| 轉(zhuǎn)膜電壓電流低 | 提高電壓/電流 | |
| 轉(zhuǎn)膜時間短 | 延長轉(zhuǎn)膜時間 | |
| 膠濃度太大 | 使用低濃度的膠 | |
| 轉(zhuǎn)膜緩沖液配方不合適 | 調(diào)整轉(zhuǎn)膜緩沖液中甲醇及SDS濃度 | |
| 背景有黑色斑點 | 抗體與封閉試劑反應 | 使用前過濾封閉試劑 |
| HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
| 暗背景上白色帶 | HRP 含量過高 | 降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
| 背景有不均勻的白色斑點 | 抗體分布不均勻 | 孵育抗體時使用搖床 |
順便給大家來幾張華美在實驗中的WB圖~
各位看官，覺得如何？
又是滿受益吧~
so~
干貨別獨享~轉(zhuǎn)發(fā)帶分享~
