在最新一期《中國(guó)生物工程雜志》上，來自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院的研究人員發(fā)表了題為“基于PCR方法的基因序列全長(zhǎng)獲取策略”的文章，介紹了基于PCR方法的基因序列全長(zhǎng)獲取方法，這將有助于基因結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)產(chǎn)物特性的研究。

高通量DNA測(cè)序技術(shù)的建立與發(fā)展為基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的建立與研究奠定了基礎(chǔ)，但是作為一種補(bǔ)充，通過酵母雙雜交、抑制性消減雜交、基因芯片技術(shù)、噬菌體表面展示等分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行特定性狀目標(biāo)基因的鑒定和分析，同樣具有重要意義。利用這些技術(shù)篩選得到的部分基因序列獲得目標(biāo)基因的全長(zhǎng)序列，為目標(biāo)基因生物學(xué)功能的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定了前期基礎(chǔ)。

對(duì)于基因組測(cè)序已經(jīng)完成的少數(shù)物種來說，可以輕松地從數(shù)據(jù)庫(kù)中找到已知序列的側(cè)翼序列，但是這只是研究少數(shù)模式生物的情況。而對(duì)于自然界中種類繁多的其他生物而言，基于PCR技術(shù)建立的多種染色體步移方法和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)實(shí)現(xiàn)了通過已知片段快速獲取未知基因序列的研究目標(biāo)。依據(jù)原理，該方法可分為反向PCR 、 外源接頭介導(dǎo)PCR和隨機(jī)引物PCR三類。各類技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，且應(yīng)用的主要領(lǐng)域和潛力各有差別。

文章介紹了反向PCR，外源接頭介導(dǎo)PCR，隨機(jī)引物PCR的各方面情況，指出，雖然早期建立的反向PCR連接效率較低，易產(chǎn)生較高的非特異性擴(kuò)增，但簡(jiǎn)單快捷的特點(diǎn)使其在鑒定T-DNA插入位點(diǎn)、基因融合位點(diǎn)等方面應(yīng)用較多，外源接頭介導(dǎo)PCR則因特異性的提高而備受歡迎，并衍生出單特異引物PCR、捕獲PCR和步降PCR等多種技術(shù)，取得了較理想的擴(kuò)增效果。

而在大量樣品分析中，自動(dòng)化程度較高的隨機(jī)引物PCR則更具優(yōu)勢(shì)。隨著功能強(qiáng)大的聚合酶、連接酶、反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了各種基于PCR的基因序列全長(zhǎng)獲取策略的發(fā)展，很多策略也因此而得以改進(jìn)和整合，并獲取更理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為研究基因結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)產(chǎn)物特性的研究提供了更完整的信息。

文章最后也指出了這些PCR方法的一些局限性，比如I-PCR必須借助于特異引物和環(huán)化處理，具有一定的特異性，外源接頭介導(dǎo)PCR雖擁有較高的特異性和類似I-PCR的實(shí)用性， 但步驟較為繁瑣。兩種方法都要進(jìn)行酶切消化， 對(duì)限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)品有一定的選擇要求， 對(duì)樣品數(shù)量及質(zhì)量也有較高要求。

而TAIL-PCR雖然采用了不適合于高度重復(fù)序列分析的隨機(jī)引物，但與多對(duì)特異引物組合，通過巢式擴(kuò)增和溫度篩選提高了反應(yīng)特異性，同時(shí)，其自動(dòng)化程度較高， 在對(duì)大量樣品及轉(zhuǎn)座子等大量插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分析時(shí)，該方法顯示了非常優(yōu)越的特點(diǎn)。

RACE技術(shù)在cDNA全長(zhǎng)序列獲取上具有快速有效特點(diǎn)，但由于poly(T)或poly(G)引物的應(yīng)用，特異性受到影響。

隨著不同方法的相互結(jié)合與滲透， 優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)， 將會(huì)促使完整基因組序列的快速高效獲取， 并逐步提高其特異性。TAIL-PCR有效減少了非特異性擴(kuò)增，PEETA法不但有效地克服了“CpG島” 的不良影響，也提高了特異性。如果兩者結(jié)合使用， 相信可以獲得更理想的結(jié)果。而將染色體步移的特異性和高效性與RACE的簡(jiǎn)單快速結(jié)合起來將會(huì)建立起新的更高效的RACE技術(shù)， 更好地服務(wù)于科研。