在納米孔單分子測序技術(shù)中，相關(guān)納米孔直徑只允許嚴(yán)格線性序列的單鏈DNA通過。納米孔可以是生物源的，如a-溶血素 (aHL) 或MspA蛋白等膜蛋白復(fù)合體。也可以由固體材料合成，如氮化硅、氧化鋁、多層石墨烯三明治、單層石墨烯或者碳納米管。納米孔包括一個能區(qū)分不同堿基的檢測區(qū)域，在堿基穿過納米孔時生成相應(yīng)的短暫信號。隨后對不同類型的信號進行評估，包括穿過納米孔的電流阻塞、跨越納米孔的隧道電流或者電容改變。

研究顯示，該技術(shù)能通過電流信號在固定于aHL 納米孔、MspA孔或穿過氮化硅納米孔的單鏈DNA片段中對5-mC和5-hmC進行區(qū)分（圖4）。該技術(shù)成功的關(guān)鍵是對DNA穿孔轉(zhuǎn)運的精確控制，在一些研究項目中科學(xué)家利用了酶活性來輔助這一技術(shù)，如將核酸外切酶或聚合酶放置在納米孔入口附近。研究顯示，使用共價結(jié)合了環(huán)糊精分子作為檢測讀取頭部的aHL納米孔，結(jié)合核酸外切酶，通過檢測殘基的納米孔電流，能夠從自由核苷酸磷酸鹽單體形式的四種標(biāo)準(zhǔn)堿基中區(qū)分5-mC。有文章顯示，該技術(shù)結(jié)合聚合酶，通過檢測DNA復(fù)制時模板鏈穿過納米孔產(chǎn)生的電流阻塞差異，能實時監(jiān)測DNA聚合酶連續(xù)添加核苷酸的過程。由于該技術(shù)是基于對DNA聚合酶的連續(xù)活性進行單分子實時監(jiān)測來進行測序，可想而知也可以通過與SMRT測序分析聚合酶動力學(xué)相同的方式對堿基修飾進行檢測。為了通過單獨監(jiān)測每個納米孔電信號獲得大量多重分析信息，有文章報道了一種可供選擇的方案，能對多個納米孔進行平行的光學(xué)讀取，但這需要將目標(biāo)DNA序列的每一個核苷酸進行轉(zhuǎn)化標(biāo)記上分子信標(biāo)，而這種樣品制備方法難以應(yīng)用于檢測堿基修飾。

有研究應(yīng)用先進的電子顯微鏡技術(shù)以單堿基的空間分辨率，對DNA模板分子的遺傳和表觀遺傳學(xué)信息進行直接讀取。包括利用透射電鏡（TEM）直接對能唯一地區(qū)分不同堿基的原子進行化學(xué)檢測。以及用碘和溴等化合物對堿基進行化學(xué)標(biāo)記，以增強檢測能力和對比度。可以想見在未來，能利用顯微鏡直接成像或堿基修飾特異性化學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)對特定堿基修飾進行檢測，如用含可檢測原子的葡萄糖標(biāo)記5-hmC或帶可檢測鏈的疊氮葡萄糖標(biāo)記（類似方法見）。

顯微鏡方法成功的一個先決條件是將各DNA分子結(jié)合到可靠的基底上。近來有研究將DNA分子轉(zhuǎn)印到單層石墨烯上（被認(rèn)為是高分辨率電鏡的最佳基底），通過高分辨率電子束照射和電子能量損失譜分析，成功應(yīng)用了使這項技術(shù)。這種方法隨后被用于檢測5-mC在DNA分子上的分布，該研究依據(jù)熒光標(biāo)記的methyl-CpG結(jié)合多肽的結(jié)合情況，能對不同甲基化水平的DNA分子進行比較，該方法目前只用于寬場熒光檢測。該文章顯示該方法也能適用于超高分辨率光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡技術(shù)，以增強空間分辨率。

還有研究報道了使用掃描隧道顯微鏡（STM）對單鏈DNA分子進行成像，通過分析STM 原子針尖、堿基和導(dǎo)電表面之間隧道電流的差異檢測四種堿基。科學(xué)家利用該技術(shù)得到了已知序列的單鏈DNA分子中的鳥嘌呤“電子指紋”。未來，可能通過這種方法得到其他堿基修飾的電子指紋。

RNA直接測序     

人們在RNA分子中發(fā)現(xiàn)了更大量的堿基修飾。這些修飾是決定重要代謝過程的結(jié)構(gòu)和調(diào)控所必須的，且與疾病發(fā)展相關(guān)。曾今由于缺少常規(guī)高通量的RNA直接測序技術(shù)，要在測序水平上進行RNA修飾研究很困難。而繁重非測序分析方法往往缺乏足夠的分辨率，大大限制了RNA堿基修飾研究。重亞硫酸鹽處理也被用于在RNA研究中檢測RNA5-mC甲基化模式。在cDNA合成過程中，特定RNA堿基修飾會引起互補cDNA鏈的堿基改變（如：腺嘌呤-肌苷修飾，肌苷在體外反轉(zhuǎn)錄中被識別為鳥嘌呤），因此能通過比較cDNA序列和同源基因組序列就能對RNA堿基修飾進行推斷。

有研究描述了基于Helicos方法的RNA直接測序short-read技術(shù)，但與DNA測序情況類似，該方法難以應(yīng)用于檢測RNA堿基修飾。在最近的文章中，通過用一個逆轉(zhuǎn)錄酶代替DNA聚合酶，研究人員應(yīng)用SMRT測序直接讀取RNA模板信息，在合成RNA模板和轉(zhuǎn)染了報告系統(tǒng)的細(xì)胞RNA中成功檢測了6-mA。

結(jié)論

DNA測序?qū)ξ覀兊纳飳W(xué)知識進行了革新，從根本上改變了生物學(xué)的研究方式。通過強大的計算方法將廣泛且高效的DNA和cDNA測序，與蛋白質(zhì)組學(xué)、生物分子動力學(xué)和大量其他表型信息結(jié)合起來，能使生物學(xué)研究形成徹底轉(zhuǎn)變，從而改善人類健康、提高食品和能源供給和加強環(huán)境保護。然而迄今為止，測序研究還主要集中在四種標(biāo)準(zhǔn)堿基和5-mC上，而這些研究所提供的DNA結(jié)構(gòu)信息明顯不足。研究顯示大量核苷酸修飾在多種重要生物學(xué)過程中起著決定性作用，包括基因表達、免疫力、疾病和致病性。此外，根據(jù)近期新堿基修飾的發(fā)現(xiàn)速率推斷，很可能功能性相關(guān)的DNA化學(xué)修飾還沒有完全被發(fā)現(xiàn)。

因此就需要加快開發(fā)高通量的自動化測序新技術(shù)，以分析A, C, G, T和 5-mC以外的DNA信息，揭示DNA的全部結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜性。在一些新興測序方法的幫助下，我們將步入揭示廣泛表觀遺傳學(xué)信息的測序革命下一階段。