作為第六種堿基，5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）近年來受到了廣泛的關注。盡管這種堿基的確切功能仍在研究中，但普遍認為它參與了DNA去甲基化或基因表達調控。若要了解5-hmC的生物學功能，研究人員必須清楚它在基因組中的位置。為此，劍橋大學和Babraham研究所的研究人員開發出一種新技術，能定位基因組中單個位點上的5mC和5hmC。該成果于4月26日發表在《Science》在線版上。

5-hmC是5-mC的羥基化形式，1952年在噬菌體DNA中首次發現。幾十年來，羥甲基胞嘧啶的研究一直圍繞著它對于噬菌體DNA的保護作用。直至近兩年，研究人員才發現它在人和小鼠大腦以及胚胎干細胞中廣泛存在，可通過TET家族的酶對5-mC的氧化而產生。5hmC與5mC的關系可能影響了干細胞的分化和發育。鑒于這一重要性，確定5hmC在基因組中的定位可能對癌癥、神經生物學以及生物學的其他方面有著非同尋常的意義。

亞硫酸氫鹽測序是發現基因組中5mC的標準方法，但它無法區分5mC和5hmC。因此，劍橋的化學家Shankar Balasubramanian及其同事在尋找一些化學反應，希望能改變其中一個核苷酸，讓它們在測序中以不同的形式讀取。

他們采用的新方法在5hmC上添加了一個氧原子，這導致其轉化成另一個修飾的核苷酸，5-甲氧基胞嘧啶（5fC）。在進入亞硫酸氫鹽的測序步驟時，這種新的核苷酸轉化成尿嘧啶。而額外的氧化步驟對5mC無影響，這樣研究人員就能區分基因組中這兩種核苷酸。

為了檢驗氧化反應是否只針對5hmC，研究人員將三條合成的雙鏈DNA（包含胞嘧啶C、5mC或5hmC）暴露在高釕酸鉀（KRuO4）中，之后開展亞硫酸氫鹽測序。實驗表明，5mC和胞嘧啶未轉化成尿嘧啶，而5hmC確實轉化成尿嘧啶。

之后，研究小組利用氧化過程來靶定小鼠胚胎干細胞的基因組DNA中的5hmC。利用氧化和亞硫酸氫鹽測序過程，他們高度精確地定位了5hmC。將此結果與標準亞硫酸氫鹽測序的數據進行比較，研究人員確定了5hmC和5mC的精確位置。

Balasubramanian認為：“這是首個以單堿基分辨率對5hmC和5mC進行定量測序的方法。此方法相當簡單，操作簡便，并與所有測序平臺兼容。倘若是全基因組測序，主要的成本仍然是測序。”

去年，美國芝加哥大學與Pacific Biosciences公司的研究人員合作，曾利用第三代單分子測序技術和5-hmC的選擇性化學標記方法來高通量檢測5-hmC。借助PacBio RS測序儀，研究人員可直接檢測DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。