能夠?qū)⑷毕莼虻墓δ苄钥截惒迦氲交颊叩幕蚪M中，對(duì)于許多從事遺傳疾病治療的臨床醫(yī)生來(lái)說(shuō)是一個(gè)誘人的目標(biāo)。現(xiàn)在，斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員設(shè)計(jì)出了一種新方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這種遺傳技能。他們的研究論文“Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”發(fā)布在10月29日的《自然》（Nature）雜志上。

這種方法不同于其他一些廣受歡迎的技術(shù)，它不需要共傳遞內(nèi)切核酸酶在特異位置剪切受體的DNA。它也不依賴于共同插入稱作為啟動(dòng)子的遺傳“on”開關(guān)來(lái)激活新基因表達(dá)。

這些差異有可能使得這一新技術(shù)更為安全及持久。利用這一技術(shù)，斯坦福大學(xué)的研究人員通過(guò)插入血友病小鼠缺失的一個(gè)凝血因子的編碼基因治愈了這些動(dòng)物。

論文的資深作者、兒科學(xué)和遺傳學(xué)教授Mark Kay博士說(shuō)：“看起來(lái)我們能夠?qū)崿F(xiàn)插入基因的終身表達(dá)，這在治療諸如血友病和重癥聯(lián)合免疫缺陷等遺傳病時(shí)尤為重要。不需使用啟動(dòng)子或核酸酶我們就能夠做到這一點(diǎn)，由此大大降低了新基因自身插入到基因組中隨機(jī)位置而引起癌癥的機(jī)會(huì)。”論文的主要作者是博士后學(xué)者Adi Barzel。

利用這一技術(shù)，Kay和同事們將缺失的一個(gè)凝血因子的功能性基因拷貝插入到了血友病小鼠的DNA中。盡管只在1%的肝細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因插入，這些細(xì)胞生成了足夠的缺失凝血因子來(lái)改善這一疾病。

有可能替代CRISPR

斯坦福大學(xué)的這一研究發(fā)現(xiàn)有可能給稱作為CRISPR/Cas9的基因組技術(shù)提供了一種替代選擇。CRISPR/Cas9技術(shù)依賴于細(xì)菌為抵抗病毒攻擊所形成的一種古老的保護(hù)性反應(yīng)。就像美洲印第安人在戰(zhàn)斗中每殺死一個(gè)敵人，便在自己帽子上插一支羽毛作為一種榮譽(yù)標(biāo)志一樣，每一次細(xì)菌戰(zhàn)勝病毒，它都會(huì)將入侵物的小部分DNA保留于自身的基因組中。累積的這些病毒區(qū)域就叫做成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)區(qū)域。當(dāng)病毒再來(lái)之時(shí)，細(xì)胞便利用保留的遺傳物質(zhì)片段來(lái)鑒別并結(jié)合到病毒基因組的匹配區(qū)域上。一旦附著，它便會(huì)利用Cas9蛋白在精確的位點(diǎn)切割病毒基因。

世界各地的研究人員不僅開始使用這種CRISPR/Cas9技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中永久地讓研究基因喪失功能，還插入了一些新的修飾基因到動(dòng)物的基因組中。這使得他們能夠快速地構(gòu)建出遺傳改造試驗(yàn)動(dòng)物；這項(xiàng)在過(guò)去要花費(fèi)數(shù)月或數(shù)年的工作現(xiàn)在只需數(shù)天或數(shù)周。

然而，CRISPR/Cas9技術(shù)不僅需要編碼Cas9核酸酶的基因（其自身就可以整合到受體的基因組中），還需要啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。研究人員擔(dān)心如果用于人類，Cas9有可能會(huì)在意外的位點(diǎn)切割DNA，這會(huì)破壞或是殺死細(xì)胞。另外，新基因的啟動(dòng)子有可能會(huì)對(duì)鄰近基因的表達(dá)造成不利的影響，引起癌癥或其他的疾病。外源的細(xì)菌蛋白還可引起患者的免疫反應(yīng)。

Barzel說(shuō)：“位點(diǎn)特異性的基因打靶是基因治療和基因組工程中最快速發(fā)展的領(lǐng)域之一。但使用核酸酶和啟動(dòng)子有可能產(chǎn)生顯著不利的影響。我想找到一種新的基因打靶方案，其不涉及載體傳送啟動(dòng)子，也不需要使用內(nèi)切核酸酶。”

研究人員設(shè)計(jì)的這一新技術(shù)沒(méi)有使用核酸酶來(lái)切割DNA，也不需要啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)凝血因子基因表達(dá)。相反，研究人員將新基因的表達(dá)與肝臟中高水平表達(dá)的albumin基因聯(lián)系在了一起。Albumin基因可編碼生成血液中最豐富的一種蛋白：白蛋白。它幫助調(diào)控了血容量，使得一些不易溶于水的分子能夠在血液中傳輸。

研究人員利用了基因治療中常用的一種病毒——腺相關(guān)病毒（AAV）的改良版本。在這一改良的病毒載體中，所有的病毒基因被刪除，只保留了治療基因。它們依賴于一種稱作為同源重組的生物學(xué)現(xiàn)象來(lái)將凝血因子基因插入到albumin基因附近。通過(guò)在兩基因間使用一種特殊的DNA接頭（linker），研究人員能夠確保凝血因子蛋白的生成與高表達(dá)的白蛋白密切關(guān)聯(lián)。

在同源重組過(guò)程中，細(xì)胞利用了自身每條染色體具有兩個(gè)拷貝這一事實(shí)。通過(guò)將受損和未受損的染色體排列在一起，細(xì)胞可以借鑒完整的拷貝來(lái)修復(fù)受損染色體，因此不會(huì)丟失至關(guān)重要的遺傳信息。Kay和Barzel利用同源重組這一自然過(guò)程，將來(lái)自病毒載體的序列拷貝到了基因組中研究人員指定的位置——在本例中，是在albumin基因的后面。

在新生和成體小鼠中都有效

當(dāng)他們?cè)谛律鷮?shí)驗(yàn)室血友病小鼠中測(cè)試他們的方法時(shí)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物開始表達(dá)凝血因子，且表達(dá)水平達(dá)到了正常水平的7-20%。以往的研究證實(shí)這樣的凝血因子量在小鼠中具有治療效應(yīng)。他們進(jìn)一步證實(shí)，這一技術(shù)令人驚奇地也可成體動(dòng)物中起作用，盡管基因只成功地插入到了不到1%的肝細(xì)胞中。

Kay說(shuō)：“我們預(yù)期這種方法能夠在新生動(dòng)物中起作用，因?yàn)樗鼈兊母闻K仍然在生長(zhǎng)。由于一直以來(lái)人們認(rèn)為同源重組大多發(fā)生在增殖細(xì)胞中，我們沒(méi)有料到它也能夠在成體動(dòng)物中起作用。”

多年來(lái)Kay一直致力于血友病的基因治療。在2006年，他作為一個(gè)研究小組的領(lǐng)導(dǎo)者，利用AAV向罹患B型血友病的患者提供了一種凝血因子基因。B型血友病沒(méi)有A型血友病那樣常見(jiàn)，每2.5萬(wàn)名男孩中有一人受累于這一疾病（由于這一疾病是由X染色體上的一個(gè)缺陷基因所引起，它很少影響女孩）。然而，由于這一缺失凝血因子的基因較小，更易于基因治療操作，因此B型血友病更容易靶向治療。

正如許多的病毒一樣，AAV也具有不同的病毒株。不幸的是，在2006年的研究中采用的這種AAV病毒株在人體表達(dá)凝血因子只維持了數(shù)月，不同于在動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期的表達(dá)。近期，英國(guó)啟動(dòng)了另一項(xiàng)相似的臨床試驗(yàn)，利用了一種不同的AAV病毒株，研究人員在患者接受改良病毒后的兩年多時(shí)間觀察到了6名患者體內(nèi)的凝血因子表達(dá)。

Kay 說(shuō)：“AAV的真正問(wèn)題在于，當(dāng)基因不整合到基因組中去時(shí)不清楚其表達(dá)將能夠維持多久。能夠從治療中最大受益的嬰兒和兒童仍然在生長(zhǎng)，由于不能在細(xì)胞之間拷貝，非整合的基因會(huì)失去它的效力。此外，由于患者會(huì)對(duì)AAV產(chǎn)生免疫反應(yīng)不太可能再給予這種治療。而獲得整合，我們就可以實(shí)現(xiàn)終身表達(dá)，且不必?fù)?dān)心癌癥或其他的DNA損傷。”

研究人員現(xiàn)正計(jì)劃在肝臟包含有人類和小鼠細(xì)胞的小鼠中測(cè)試這一技術(shù)，他們近期證實(shí)了這種模型可以是進(jìn)一步預(yù)測(cè)人體中所發(fā)生事件的一個(gè)好的替代物。